[发明专利]一种RNA反义纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种RNA反义纯化方法。

背景技术

长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是长达两百个核苷酸以上的转录本，绝大多数位于细胞核内。虽然lncRNA没有编码任何蛋白质，但它们在不同组织和发育阶段的表达依然具有特异性，这说明lncRNA具有重要的生物学意义。在测序技术的帮助下，人们已经发现了数千种lncRNA，但这些lncRNA的生物学功能依然还是个谜。

2013年，Jesse M.Engreitz教授开发了RNA反义纯化(RNAantisensePurification，RAP)技术，该技术可以在转录后水平鉴定RNA与RNA及相关DNA和蛋白质的互作。其原理如下：首先用紫外交联固定细胞，以维持如lncRNA等调控RNA与RNA、RBP的相互作用，然后进行细胞裂解，接着用生物素标记的寡核苷酸探针组与靶lncRNA杂交，基于生物素和链霉亲和素相互作用的原理，用链霉亲和素磁珠来分离、纯化探针-基因或蛋白质复合体，最后从纯化的复合体中分离蛋白质或RNA，以进行下游的分析。

RAP技术被不同领域的研究者们广泛采用。如Engreitz J M等(2013)利用RAP技术通过研究LncRNA Xist成功地阐释了Xist使X染色体失活的作用机理(Engreitz J M,Pandyajones A,Mcdonel P,et al.The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome[J].Science,2013,341(6147):L35-L38.)。随着人们进一步认识非编码RNA在转录后水平发挥的重要作用，研究者对RAP技术进行不断的完善，旨在阐明lncRNA在机体内与内源性RNA、蛋白质的互作关系。2014年，Engreitz J M及其同事们运用RAP技术研究了核内小RNA U1和lncRNA Malat1与前体mRNA互作的作用机理。通过使用不同交联试剂及交联条件，改进的RAP技术能够进一步研究体内RNA-RNA互作关系及RNA在染色体上的定位及参与的转录调控(Engreitz J,Sirokman K,Mcdonel P,et al.RNA-RNA Interactions Enable Specific Targeting of Noncoding RNAs to Nascent Pre-mRNAs and Chromatin Sites[J].Cell,2014,159(1):188-99.)。

然而，现有RAP技术因磁珠会吸附非特异性的核酸及蛋白质、探针组与RNA杂交的效率不高、核酸及蛋白质等产品回收效率不高等问题而存在特异性低、灵敏度不佳的缺点。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种RNA反义纯化方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种RNA反义纯化方法，包含以下步骤：

S1、细胞的交联、裂解及基因组DNA的消化，得到RNA样品；

S2、探针组溶液的制备：将生物素标记的各探针溶解后混合，于85℃变性3min，快速转移冰浴，得到探针组溶液；

S3、磁珠预处理：使用BSA(牛血清白蛋白)和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；

S4、探针组-磁珠复合物的制备：将探针组溶液加入到预处理后的磁珠中，得到探针组-磁珠复合物；

S5、反义纯化：向RNA样品中加入探针组-磁珠复合物，65℃变性10min，37℃、42℃和45℃各洗涤2次，每次洗涤5min，得到RNA-探针组-磁珠复合物；

S6、RNA的洗脱：将RNA-探针组-磁珠复合物加入RNA ElutionBuffer混匀，95℃加热2min，收集上清，向上清中加入Proteinase K Buffer和Proteinase K，温育消化得到洗脱后的RNA；

S7、RNA的纯化：向洗脱后的RNA中加入等洗脱体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合液混匀，离心收集上层水相，向水相中加入5M NaCl溶液、glycogen和无水乙醇，混匀后-80℃沉淀1～16h，离心弃上清，加入预冷的80％乙醇，离心弃上清，室温静置风干，加入无RNase水，65℃温育15min。