[发明专利]一种提高哺乳动物细胞中外源基因表达水平的基因片段、重组载体及其用途

说明书

本发明公开了一种提高哺乳动物细胞中外源基因表达水平的基因片段，其特征在于：其核苷酸如SEQ ID NO.1或2所示。本发明还公开了一种重组质粒，它是将pcDNA3.1(+)质粒中启动子CMV替换为CHEF‑alpha基因5’端的长度为1543bp序列，以及BGHPA替换为CHEF‑alpha基因3’端的长度为610bp序列，在启动子上游插入鸡溶菌酶MAR序列，筛选标记基因Neo替换为DHFR基因的重组质粒。本发明还公开了重组质粒的用途。本发明重组质粒携带外源基因转染哺乳细胞，外源基因的表达水平高，且外源基因的表达水平可以持续稳定高产，应用前景良好。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种提高哺乳动物细胞中外源基因表达水平的基因片段、重组载体及其用途。

背景技术

中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是生物制药中最常用的哺乳动物细胞，是外源真核基因的最佳表达系统之一，在生物制药中被广泛应用，目前已经上市和正在进行临床研究的基因工程药物中大约有60-70％为哺乳动物细胞表达产品，而CHO细胞表达产品占其中的绝大部分。与原核表达系统比较具有如下优点：外源蛋白容易在CHO细胞中合成并分泌到培养基中；重组蛋白的折叠与修饰、理化性质、生物学性质几乎与天然蛋白相同；能正确组装多亚基蛋白；能大规模高密度无血清培养。但是，与原核、酵母表达系统相比其表达量低难以大量制备一直是该表达系统的问题，特别是临床使用剂量达到数十至数百毫克级乃至克级水平的生物工程药物的应用，提高表达量就成了直关重要的问题。

启动子的强弱直接关系到外源基因在宿主细胞中的表达水平，为提高外源基因的转录效率，必须尽可能的选用高活性的启动子。目前在真核细胞中最常用的启动子为人的CMV启动子，它有比较广泛的宿主细胞，也是比较强的启动子。但是研究发现，该启动子内存在CpG岛容易导致沉默效应；仅在细胞周期的S期起作用，因此寻找比CMV更好的启动子是必要的。人们一直在寻找，高强度适应性广的启动子，Kalwy S用鼠的mCMV启动子在CHO-K1细胞中表达EGFP，是人的CMV启动子的3倍，但在表达抗体这样的蛋白时，表达能力却比较弱不如人的CMV启动子。Gershon TJ等通过人工设计合成了一个能够增加基因表达的核心启动子，体内外研究表明：它比CMV核心启动子显著性提高报告基因荧光素酶的表达水平，这就为寻找高活性启动子提供了另一种思路，有可能创造出自然界不存在的高强度的人工启动子。ProBioGen公司，克隆了细胞内广泛存在的启动子，强度比CMV强，非细胞周期依赖，能够对抗基因沉默，在细胞中稳定表达50代以上，很可能细胞内源性启动子更有利于重组蛋白基因的转录调控。