[发明专利]嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、CARHER2-NKT细胞及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为HER2ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括串联的CD8a信号肽、HER2ScFv、缩短CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域；优选地，所述嵌合抗原受体具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，进一步优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的嵌合抗原受体的基因，优选地，所述基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，进一步优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求2所述的基因的重组表达载体，优选地，所述重组表达载体为慢病毒表达载体，进一步优选地，所述慢病毒表达载体为pWPT-HER2ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。

4.一种工程化HER2靶向性的NKT细胞，其特征在于，所述NKT细胞是由权利要求1所述的嵌合抗原受体修饰的NKT细胞。

5.一种工程化HER2靶向性的NKT细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

包装携带pWPT-HER2ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的慢病毒，得到病毒浓缩液；利用得到的病毒浓缩液感染NKT细胞，使NKT细胞表达嵌合抗原受体HER2ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述方法还包括通过如下方法制备NKT细胞：

(1)在CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将单个核细胞进行第一阶段培养；优选地，所述第一阶段培养的实施方式包括：将单个核细胞培养于第一NKT细胞培养液中，所述第一NKT细胞培养液含有NKT细胞培养基、CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15；进一步优选地，第一NKT细胞培养液中，所述CD3单克隆抗体的浓度为30-70ng/mL，和/或所述白介素-2的浓度为300-700U/mL，和/或所述白介素-15的浓度为30-70ng/mL；

(2)在白介素-2存在下，将所述第一阶段培养的细胞进行第二阶段培养；优选地，所述第二阶段培养的实施方式包括：将所述第一阶段培养的细胞培养于第二NKT细胞培养液中，所述第二NKT细胞培养液中含有NKT细胞培养基和白介素-2；进一步优选地，第二NKT细胞培养液中，所述白介素-2的浓度为300-700U/mL。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述感染NKT细胞的方法包括：

(1)在病毒浓缩液、鱼精蛋白和白介素-2存在下，将NKT细胞进行第一阶段感染培养；优选地，所述第一阶段感染培养的实施方式包括：将NKT细胞培养于第三NKT细胞培养液中，所述第三NKT细胞培养液含有NKT细胞培养基、病毒浓缩液、鱼精蛋白和白介素-2；进一步优选地，第三NKT细胞培养液中，所述白介素-2的浓度为300-700U/mL；

(2)在CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将所述第一阶段感染培养的细胞进行第二阶段感染培养；优选地，所述第二阶段感染培养的实施方式包括：将所述第一阶段感染培养的细胞培养于所述第一NKT细胞培养液中。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述感染NKT细胞的方法还包括：

(3)先在白介素-2存在下，将所述第二阶段感染培养的细胞进行体外诱导，待细胞的密度为80-90％时，再在CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将细胞进行扩增培养；优选地，所述体外诱导的实施方式包括：将所述第二阶段感染培养的细胞培养于所述第二NKT细胞培养液中，所述扩增培养的实施方式包括：将细胞培养于所述第一NKT细胞培养液中。

9.权利要求5-8中任意一项所述方法制备得到的工程化HER2靶向性的NKT细胞。

10.权利要求4或9所述的工程化HER2靶向性的NKT细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用，优选地，所述肿瘤是进展期HER2阳性的上皮肿瘤，进一步优选地，所述上皮肿瘤为胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、食管癌、前列腺癌、胃癌或口腔癌。