[发明专利]一种用于检测中性粒细胞呼吸爆发功能的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测中性粒细胞呼吸爆发功能的试剂盒，属于检验技术领域。

背景技术

正常机体受到外界病原微生物等的刺激后，通过一系列固有免疫和适应性免疫反应抵抗感染、行使免疫防御功能。其中，固有免疫是机体先天获得的第一道防线，出现早且反应迅速，在机体清除病原体的过程中发挥重要作用。中性粒细胞是固有免疫系统的重要组成部分。中性粒细胞在吞噬病原体过程中产生超氧阴离子和其他反应性氧复合物，即“呼吸爆发”，参与机体非特异性的抗感染过程。中性粒细胞呼吸爆发功能缺陷常见于临床上的慢性肉芽肿患者，以及其他生理病理或药物作用导致中性粒细胞功能缺陷的患者。慢性肉芽肿一种罕见的原发性免疫缺陷病，患者由于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶复合物组分缺陷，不能产生活性氧中间体(reactive oxygen intermediates，ROI)，因此临床表现反复细菌和真菌感染，严重者可危及生命。目前已发现慢性肉芽肿有2种不同的遗传方式，即X染色体隐性遗传(CYBB基因缺陷导致)和常染色体隐性遗传(CYBA、NCF1、NCF2和NCF4基因缺陷导致)两种方式。由于该病的临床表现与其他免疫缺陷类疾病以及感染类疾病十分类似，因此仅通过临床表现并不能将其与其他病种区分开来。因此，慢性肉芽肿病临床上主要是基于体外检测中性粒细胞刺激后消耗氧和产生氧代谢物是否缺陷来诊断的。然而目前，国内仅有北京和上海少数几家儿童专科医院能够行中性粒细胞呼吸爆发功能检测实验，绝大多数医院不具备检测技术和条件。大部分疑似病例需要从外地赶至北京上海进行相关检测，成本高且不易操作。另外，由于各家医院检测手段不完全相同，没有统一的判断标准。尤其针对常染色隐性遗传的患者来说，由于其中性粒细胞呼吸爆发功能并非完全丧失，因此实验偏差很容易影响到临床医师最后的诊断结果。另外，国内市场上仅有一家公司在售相关试剂盒，但未排除内源性过氧化氢酶对于实验结果的影响，这将会导致实验结果的不稳定性。因此，研发、制备稳定的中性粒细胞呼吸爆发功能检测试剂盒将极大地促进慢性肉芽肿病的诊断，并可促进中性粒细胞呼吸爆发功能相关的临床诊断和基础研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定的用于检测中性粒细胞呼吸爆发功能的试剂盒。本发明的试剂盒用于检测中性粒细胞产生活性氧的能力，尤其适用于临床筛查慢性肉芽肿患者，亦可用于其他各种生理病理条件，以及药物作用对于中性粒细胞呼吸爆发功能的影响。本试剂盒不仅限于人类样本的检测，还可用于其他物种，包括小鼠、大鼠、兔、狗、牛、猪等。

为实现上述目的，本发明中，我们提供一种用于检测中性粒细胞呼吸爆发功能试剂盒。该试剂盒主要基于二氢罗丹明123(Dihydrorhodamine 123,DHR123)流式细胞分析法，利用少量的周血全血即可完成检测。其原理为：首先在测试样本中加入过氧化氢酶以分解内源性的过氧化氢，消除样本间差异，然后加入DHR123。DHR123是一种小分子化合物，可自由进入细胞。再加入佛波酯(Phorbol Myristate Acetate,PMA)溶液，中性粒细胞在PMA的刺激下可产生过氧化氢等活性氧。DHR123在过氧化氢和超氧阴离子等活性氧的作用下DHR123可生成罗丹明123(rhodamine123,R123)，产生绿色荧光。通过流式细胞术检测绿色荧光的表达情况即可判断中性粒细胞产生活性氧的能力。本发明的技术方案具体介绍如下。

一种用于检测中性粒细胞呼吸爆发功能的试剂盒，该试剂盒包括如下组分：PMA溶液、DHR123溶液、过氧化氢酶溶液、平衡液、洗涤液、红细胞裂解液和稀释液。

本发明中，PMA溶液的浓度是20μg/ml；DHR123溶液的浓度是90μg/ml；过氧化氢酶溶液的浓度是20U/μl。

本发明中，平衡液为生理盐水；洗涤液为PBS溶液；稀释液为PBS溶液。

本发明中，试剂盒用于检测中性粒细胞呼吸爆发功能的方法如下：

第一步，取受试样本，置于流式细胞管底部，检测分别为静息组、对照组和实验组，每管50μl；如果受试样本为血液样本，则每管加入1ml 1x红细胞裂解液，室温避光孵育8～15分钟；然后离心，去除上清，并用洗涤液清洗1-2次，每管加入50μl稀释液；如果受试样本为细胞样本，则洗涤后直接加入50μl稀释液；