[发明专利]一种基于氟固相萃取富集含半胱氨酸肽段并进行质谱分析的方法

说明书

本发明属分析化学及蛋白质分析领域，涉及氟固相萃取新方法,具体涉及一种利用氟化石墨为固相吸附剂分离富集含半胱氨酸肽段的方法。本发明使用氟化石墨作为氟固相萃取的固相吸附剂，利用氟化石墨表面与目标分析物氟标签的氟‑氟作用，有效地分离目标分析物和杂质。本发明中所使用的氟化石墨相比于传统的氟固相萃取吸附剂，避免了高纯度二氧化硅基质及高氟化硅烷偶联剂的使用，具有成本低、选择性好、检出限低、回收率高、普及度高等特点，可以实现含半胱氨酸肽段的分离富集和质谱鉴定。

技术领域

本发明属分析化学及蛋白质分析领域，涉及氟固相萃取新方法,具体涉及一种利用氟化石墨为固相吸附剂的氟固相萃取技术，以及利用该技术分离富集蛋白酶解肽段中半胱氨酸肽段的方法。

背景技术

现有技术公开了氟固相萃取是在有机合成和催化中被广泛使用的技术。该技术通过对目标化合物进行氟试剂衍生，利用氟-氟相互作用，依靠高氟化的固相吸附剂对目标化合物进行分离纯化。实践显示，该技术相比于传统的生物素标签，氟标签与质谱技术的兼容性更佳，因此近年来在各类“组学”研究（如蛋白质组学、糖组学、代谢组学）中得到较为良好的应用。研究显示，随着有机氟化学的发展，带有氟标签的衍生试剂种类繁多，极大地推动了氟固相萃取技术的发展，但由于传统的高氟化固相吸附剂多为采用二氧化硅为基质，键合高氟化的硅烷偶联剂制作而成，其成本相对较高，限制了氟固相萃取技术的进一步普及。氟化石墨是一类廉价易得的高氟化材料，在工业上常被用作为固相润滑剂和锂电池阴极材料，但尚未见氟化石墨材料被用作氟固相萃取的固相吸附剂的报道。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种氟固相萃取的新方法,具体涉及采用氟化石墨作为固相吸附剂，建立分离富集含巯基肽段并质谱分析的新方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷与不足，提供一种氟固相萃取新方法，具体涉及一种利用氟化石墨为固相吸附剂分离富集含巯基肽段的新方法。尤其是一种基于氟固相萃取富集含半胱氨酸肽段并进行质谱分析的方法。

本发明的目的通过下述的技术方案施现：

1.首先对目标分析物进行氟试剂衍生；

2.利用氟化石墨分离富集目标物；

3.将目标物从氟化石墨上洗脱；

4.对目标物进行质谱分析。

具体地，本发明的基于氟固相萃取富集含半胱氨酸肽段并进行质谱分析的方法，其包括，首先对目标分析物（含有自由巯基的酶解肽段）进行氟试剂衍生；再基于氟化石墨进行氟固相萃取，从而分离目标分析物与杂质；之后对目标分析物与杂质进行进一步的分析。

更具体的，本发明的基于氟固相萃取富集含半胱氨酸肽段并进行质谱分析的方法，其特征在于，采用氟化石墨为固相吸附剂，利用氟化石墨表面与目标分析物所带氟标签之间的氟-氟相互作用，实现对目标化合物的选择性富集；本发明的实施例中，针对含有半胱氨酸的肽段，首先对其进行氟标签的衍生，然后利用氟化石墨进行氟固相萃取，从而分离富集目标肽段，进行进一步的质谱分析，其包括步骤：

（1）在含有自由巯基肽段的多肽样品中，加入带有碘乙酰胺反应基团的氟标签衍生试剂，在含有20%-60%乙腈（体积比）、25-100毫摩尔/升碳酸氢铵的水溶液中进行氟标签衍生，反应的时间为1-4小时，反应温度为37-60摄氏度；

（2）在含有20-60%甲醇（体积比）、25-100毫摩尔/升碳酸氢铵的水溶液中，加入1-4毫克氟化石墨以及氟标签衍生后的多肽样品，均匀分散，共孵育5-30分钟，结合离心分离的方法，收集下层固体；

（3）用（2）中所用共孵育溶液清洗固体相，每次清洗后，结合离心分离的方法，收集下层固体，洗涤次数为2-3次，每次清洗的时间为5-10分钟；