[发明专利]一种诱导菠菜根尖细胞有丝分裂同步化的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物细胞遗传学技术领域，具体涉及一种诱导菠菜根尖细胞有丝分裂同步化的方法。

背景技术

染色体是细胞核中最重要的组成部分，染色体数目和结构的变异为植物育种提供了丰富的遗传资源。根尖细胞有丝分裂中期制片是一项基本的细胞遗传学研究技术和手段，该技术以及以此技术为基础的核型分析和荧光原位杂交等技术在物种鉴定和鉴别、物种间亲缘关系确定、物种倍性鉴定和杂交育种等研究中有广泛的应用。

菠菜是苋科藜亚科菠菜属1年生或2年生草本植物，其叶片富含铁、叶黄素、叶酸、维生素、矿物质以及抗氧化剂，是一种重要的经济类绿叶蔬菜。菠菜通常情况下为雌雄异株，但少数情况下也会出现雌雄同株。其遗传组成为2n=2x=12，性别由XY染色体决定。近年来，对菠菜的研究主要集中在营养成分、栽培及分子生物学等方面，对其细胞学的研究相对滞后，这主要是由于菠菜的细胞质浓厚，细胞壁较坚硬，染色体较小，很难获得形态清晰、分散良好的分裂相。并且，尽管菠菜根尖的分生组织区分裂活动比较旺盛，但分裂中期的细胞仅占据很少一部分，大部分细胞仍处于间期，这为获得理想的染色体制片造成了很大障碍，往往需要进行大量的染色体制片，才能挑选出少量理想的可用于分析及后期实验的玻片，浪费大量的人力、物力和时间。诱导植物细胞周期同步化可以使处于分裂中期的细胞比例大大增加，使染色体制片的成功率和稳定性大大提高。但是对于菠菜，甚至苋科还没有相关的报道。目前最常用的方法是采用羟基脲（HU）和甲基氨草磷（APM）双阻断法诱导植物细胞有丝分裂同步化，可获得高频率有丝分裂中期指数。但是，HU和APM都有毒性，并且经APM处理后，菠菜根尖细胞染色体容易拖尾，形态不好，不利于进行后期的更深入的研究和分析。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种诱导菠菜根尖细胞有丝分裂同步化的方法。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种诱导菠菜根尖细胞有丝分裂同步化的方法，其特征在于：采用羟基脲和N₂O双阻断法诱导菠菜细胞进行同步化有丝分裂以获得大量中期分裂相细胞。

本发明所述的诱导菠菜根尖细胞有丝分裂同步化的方法，其特征在于具体步骤为：

（1）根尖培养：将菠菜种子在30℃的水中浸泡24h，再将种子放在铺2-3层用水浸湿的滤纸的培养皿中，然后于25℃培养4天至根长为0.5-1.5cm；

（2）羟基脲处理：在25℃条件下用摩尔浓度为3mmol/L的羟基脲处理根长为0.5-1.5cm的菠菜种子18h；

（3）恢复培养：将羟基脲去除，用清水清洗种子三遍，然后在25℃的清水中培养根尖6-8h；

（4）N₂O预处理：切取根尖放入N₂O气室中处理1-3h；

（5）固定：用体积分数为90%的乙酸冰上固定根尖10min。

进一步优选，步骤（1）中菠菜根长优选为1cm。

进一步优选，步骤（3）中清水培养根尖的时间优选为7h。

进一步优选，步骤（4）中N₂O的处理压强为1.01MPa，N₂O的处理时间优选为2h。

进一步优选，经过步骤（5）处理后，将固定好的根尖水洗后置于离析液中离析1.5min，该离析液是体积比为1:1的浓盐酸与无水乙醇的混合液，再水洗去除离析液后切下2mm长的根尖生长点部分放在载波片上，充分切碎后滴加改良品红染液染色15min，加上盖玻片进行常规压片，然后将玻片置于显微镜下观察，拍照并计算有丝分裂中期分裂相比例。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、使用HU可使细胞阻断在分裂间期，去除HU后进行恢复培养，可诱导细胞进行同步化，经过6-8h的恢复培养，使大量细胞位于细胞分裂的中期，经预处理、固定及压片后，有丝分裂中期细胞的比例大大增加；

2、本发明采用N₂O预处理根尖，可有助于去除细胞质背景，使染色体形态良好，且方法简单，另外，在制片过程中，可显著减少对环境和人体的污染和毒害风险；

3、采用本发明可获得大量的菠菜中期分裂相，使菠菜染色体标本制备的成功率大大提高，节省大量的人力、物力和时间；

4、采用本发明的方法可以为菠菜染色体标本的制备提供便利，对于菠菜染色体物理图谱构建、遗传育种、性染色体进化研究以及菠菜属植物的进化研究等具有重要的理论和实践价值。

附图说明

图1为菠菜根尖同步化后常规压片所观察到的细胞图；