[发明专利]一种沉默T细胞抗原受体的T淋巴细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种沉默T细胞抗原受体的T细胞制备方法，本发明是一种RNA干扰技术，特别是双靶点干扰技术沉默T细胞抗原受体，本发明还涉及表达shRNA的T细胞，所述T细胞可沉默自身的T细胞抗原受体，对异体来源的组织降低排斥作用。

技术领域

本发明涉及生物与新医药技术领域，更具体的说，是一种沉默T细胞抗原受体的T淋巴细胞的制备方法。

背景技术

T淋巴细胞是在胸腺中分化成熟的淋巴细胞，故称胸腺依赖性淋巴细胞(Thymus-dependent lymphocyte)，简称T细胞。T细胞是由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中数量最多，功能最复杂的一类细胞。T细胞膜表面分子与T细胞的功能相关，也是T细胞的表面标志，可以用以分离、鉴定不同亚群的T细胞。TCR为所有T细胞表面的特征性标志，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。TCR的作用是识别抗原。TCR是由两条不同肽链构成的异二聚体，由α、β两条肽链组成，每条肽链又可分为胞外区、跨膜区和胞质区等几部分；其特点是胞质区很短。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于胞外区。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgenesilencing)。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。

机体对内外的各种致病因子有着非常完善的防御机制，其中对外来物如细菌、病毒、异物等“异己成分”的重要作用，就是攻击、破坏、清除。这主要是由于T细胞抗原受体的识别作用。每个机体内的T细胞抗原受体都是特异的，遇到来源于异体的T细胞时会发生免疫反应。而在细胞免疫治疗技术的应用中，当病人因身体虚弱，导致自体外周血中T细胞数量比较少，很难在体外诱导成CIK细胞，因此，应用异体T细胞对病人免疫治疗具有潜在优势。

发明内容

为了弥补以上不足，本发明提供了一种沉默T细胞抗原受体的T淋巴细胞的制备方法，本发明为一个双靶点的RNA干扰技术，表达所述双靶点RNAi的T淋巴细胞，以及所述T淋巴细胞用于异体回输降低排斥反应的用途。

本发明的方案是：

一种沉默T细胞抗原受体的T细胞制备方法，在TCR的α链和β链基因中分别选取连续的21个核苷酸，并与相应的启动子序列依次连接起来，得到转录形成TCR-RNAi的融合基因片段，将所构建的融合基因片段插入慢病毒表达载体，包装成携带TCR-RNAi融合基因的慢病毒，将所述携带TCR-RNAi融合基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞，得到沉默T细胞抗原受体的T淋巴细胞。

作为优选的技术方案，所述的转录TCR-RNAi的融合基因片段为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。

作为优选的技术方案，所述单核细胞诱导的异质T淋巴细胞如下制备：取脐带血，分离单核细胞，用含有重组干扰素的培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素、OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时；每隔三天倍比加液，培养至第17天，流式细胞术检测CIK细胞的分子标记TCR+的阳性表达率；当TCR+阳性率>90％，收获由单核细胞诱导的异质T淋巴细胞。