[发明专利]靶向EMS1/cortactin的多靶位siRNA分子及应用

说明书

本发明属于靶向肿瘤相关基因的siRNA分子的技术领域，涉及靶向EMS1/cortactin的多靶位siRNA分子及应用，包括如下序列：EMS1/cortactin siRNA‑5的正义链和反义链；EMS1/cortactin siRNA‑6的正义链和反义链；EMS1/cortactin siRNA‑7的正义链和反义链，通过转染人肝癌（HCC）SMMC‑7721细胞系以抑制EMS1/cortactin表达，基因水平约为80%，下调水平较为稳定和准确，多靶位siRNA联合作用于HCC基因芯片检测、EMS1/cortactin表达对HCC转移调控分子机制研究和靶向EMS1/cortactin的抗转移核酸药物制备。

技术领域

本发明属于靶向肿瘤相关基因的siRNA分子的技术领域，涉及靶向EMS1/cortactin的多靶位siRNA分子及应用。

背景技术

原发性肝癌(HCC)是一种多基因改变的复杂和异构肿瘤，多数病人死于术后的复发和远处转移。肝癌细胞的侵袭性在HCC复发和远处转移中发挥重要作用。研究表明，细胞膜下存在一层0.2-0.5微米厚的透明区域，称为细胞皮层。该层结构主要由肌动蛋白微丝相互交联构成，与细胞骨架重组，细胞运动，信号转导等重要生理活动密切相关^[1]。EMS1基因定位于人类染色体11q13，其编码蛋白具有与细胞皮质区内肌动蛋白结合的能力，故称之为皮动蛋白(actin-binding protein，cortactin)。EMS1/cortactin在肌动蛋白聚合过程中发挥关键性作用，并且调节细胞骨架和运动^[2-3]。有关EMS1/cortactin与HCC迁移、侵袭密切相关的文献报道较多，但具体机制尚未研究清楚。

核酸干扰技术(RANi)经典作用在于特异性敲除或敲低某一特定基因片段，从而阐明该基因功能，并将其用于疾病治疗。由于EMS1/cortactin mRNA基因全长3319bp，单一靶点siRNA有时存在沉默效果不佳，性能不稳定，脱靶效应等问题，不利于下游实验开展，故本发明拟将RNAi的作用靶点选择在靶基因启动子下游75位碱基之后，同时进行多个RNAi靶点的联合抑制。通过多靶位siRNA联合作用，稳定敲低HCC细胞中EMS1/cortactin水平。

申请人拟将同时靶向EMS1/cortactin多个位点的siRNA联合转染入HCC细胞，通过RT-qPCR实验、人类全转录组cDNA基因芯片(Affymetrix Human Prime view)检测等，研究EMS1/cortactin水平下调后，HCC细胞中下游基因的具体变化，并将此实验结果与使用单一靶点siRNA的作用效果相对比，分析多靶位siRNA在抑制率和稳定性等方面是否具有有益效果。同时通过分析HCC细胞中EMS1/cortactin水平下调后，细胞中变化基因对应生物过程、分子功能等，进一步阐述EMS1/cortacitin表达与HCC迁移侵袭信号转导的具体关系，并明确其机制。研究结果为稳定抑制人HCC EMS1/cortacitin水平和研发靶向EMS1/cortactin抗转移的核酸药物提供有益的探索，为探讨HCC转移机制和临床控制HCC转移提供更有针对性的思路。

[1]喻丹，张培军.皮动蛋白及微丝相关蛋白2/3复合物介导的细胞运动的分子机制[J].生命的化学2005，25(3)：226-228.

[2]Uruno T，Liu J，Zhang P，et al.Activation of Arp2/3complex-mediatedactin polymerization by Cortactin[J].Nature cell biology 2001，3：259-266.

[3]Bryce NS，Clark ES，Leysath JL，et al.Cortactin promotes cellmotility by enhancing lamellipodial persistence[J].Current Biology 2005，15：1276-1285.

发明内容