[发明专利]一种重组枯草芽孢杆菌产透明质酸裂解酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组枯草芽孢杆菌产透明质酸裂解酶的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

透明质酸酶(hyaluronidase)是对催化降解透明质酸酶的通称。透明质酸酶分布较广，在蛇毒、蜂毒、蝎毒以及蜘蛛等的毒液中都检测到了透明质酸酶。在人体组织及体液中也发现广泛存在着透明质酸酶。此外，一些细菌、真菌以及非脊椎动物如水蛭、甲壳类动物等也产生透明质酸酶。1971年，Meyer根据透明质酸酶作用机制的不同，将其分为三类：第一类是内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(EC 3.2.1.35)，为水解酶，作用于β-1，4糖苷键，降解终产物主要为四糖，也可作用于软骨素或硫酸软骨素，并有转糖苷活性。哺乳动物来源和动物毒液来源的透明质酸酶属于此类。研究最多的是睾丸、蜂毒以及溶酶体透明质酸酶；第二类是水蛭、十二指肠来源的透明质酸酶，为内切-β-葡糖苷酸酶(EC 3.2.1.36)，作用于β-1，3糖苷键，也为水解酶，主要降解终产物为四糖，可特异性降解透明质酸；第三类是细菌来源的透明质酸酶(EC 4.2.2.1)，此类为透明质酸裂解酶(hyaluronate lyase)，作用于β-1，4糖苷键，通过β-消去机制得到4，5-不饱和双糖。

近年开始用X-射线晶体衍射法研究透明质酸酶的结构和作用机制。目前见到报道的有Streptococcus pneumoniae和S.agalactiae(B族Streptococcus，GBS)透明质酸酶。完整的细菌透明质酸酶包含4个结构域：N末端的糖结合域，间隔域，催化反应域，和C末端调节域，两个末端结构域与相邻结构域间由一段连接多肽相连。

产透明质酸酶的微生物包括很多革兰氏阴性与阳性菌，革兰氏阴性菌所产酶大多存在于周质空间，不大可能与发病机制相关。这些菌有Aeromonas，Bacteroides，Fusobacterium等。而产透明质酸酶的革兰氏阳性菌有Streptococcus，Staphylococcus，Clostridium，Propionibacterium，Peptostreptococcus以及Streptomyces。其中，对于链球菌透明质酸酶的报道很多且深入。引人注目的是，这些菌大多都是致病菌，可引起人或动物的皮肤或粘膜感染，利用产生的酶降解透明质酸，破坏其防御体系，降低粘度，便于入侵。温和噬菌体如Streptococcus pyogenes和S.equi的透明质酸酶，基因序列间有很大同源性，但与细菌透明质酸酶的序列相似性很小。噬菌体透明质酸酶以多聚体存在，且能专一性降解透明质酸，并且为非进行性降解。S.pyogenes噬菌体携带透明质酸酶穿透细菌荚膜，到达受体部位，进而感染细菌。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产透明质素裂解酶的重组枯草芽孢杆菌，是在枯草芽孢杆菌中导入编码透明质酸裂解酶的基因，诱导表达透明质酸裂解酶。

本发明的另一目的在于提供上述重组枯草芽孢杆菌在生产透明质素裂解酶中的应用。

本发明的有一目的在于提供一种生产透明质素裂解酶的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种产透明质酸裂解酶的重组枯草芽孢杆菌，是在枯草芽孢杆菌中导入编码透明质酸裂解酶的基因构建得到的，所述编码透明质酸裂解酶的基因具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，该基因重组整合在枯草芽孢杆菌基因组上，并置于木糖诱导型启动子P_xylA下诱导表达。

本发明中编码所述透明质酸裂解酶的基因是来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)噬菌体H4489A的HylP；HylP的核苷酸序列具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。编码透明质酸裂解酶的基因HylP重组整合在基因组上进行诱导表达，启动子为木糖诱导型启动子P_xylA。

所述透明质酸裂解酶的N端带有信号肽amyX和组氨酸标签6×His-tag。所述信号肽amyX的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

在枯草芽孢杆菌中导入编码透明质酸裂解酶的基因的过程是构建含有透明质酸裂解酶基因的重组质粒，将含有透明质酸裂解酶基因的重组质粒转化枯草芽孢杆菌。优选的，上述的含有透明质酸裂解酶基因的重组质粒采用以下步骤构建：

(1)设计引物HylP-F、HylP-R，以基因合成的pUC19-HylP为模板，进行PCR扩增获得HylP基因片段；设计引物AmyX-F、AmyX-R，以质粒pMA0911-amyX为模板，进行PCR扩增获得amyX片段；