[发明专利]一种经由细胞片层获得磷酸钙/细胞外基质薄膜的方法

说明书

本发明公开了一种经由细胞片层获得磷酸钙/细胞外基质薄膜的方法，细胞外基质的来源为成纤维细胞、成骨细胞等。制备该薄膜主要通过在TiO₂纳米点薄膜基板上进行高密度培养细胞，形成细胞片层后，通过光致细胞脱附，获得一层完整的细胞片层，将其清洗后再进行固定、复合、干燥处理后得到磷酸钙细胞外基质薄膜。本发明的细胞外基质薄膜，可应用于组织工程等领域。此外本发明的制备方法，工艺简单，易于实现，有利于进行推广应用。

技术领域

本发明涉及组织工程领域，具体涉及一种经由细胞片层获得细胞外基质薄膜的方法。

背景技术

细胞外基质为宿主细胞提供一切生命活动所必须的物质和信号的支持，它是细胞生长过程分泌的胶原、糖蛋白、蛋白聚糖以及多种生长因子等组成的复杂网络结构，对细胞的形状、生长、迁移和分化，胚胎的发育以及受损组织或器官的修复等有至关重要的作用。有学者通过机械剥离法获得一层较厚纤维母细胞片层，并通过去细胞化制备得到纤维状的细胞外基质膜，研究发现，所获得的细胞外基质薄膜能够促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[Qi X,Qian Z,Kannan B,et al.Osteogenic Differentiation Evaluation ofan Enginee red Extracellular Matrix Based Tissue Sheet for PotentialPeriosteum Re placement[J].Acs Applied Materials&Interfaces,2015,7(41)]。因此，如能在体外获得细胞外基质薄膜具有很强的实际应用意义和研究价值。

在体外培养过程中，细胞本身可分泌出细胞外基质并形成包含了细胞外基质及细胞的细胞薄层，但这之后通常的处理方式是酶处理，消化掉细胞外基质使细胞脱离培养表面，无法获得所需的细胞外基质。而如单采用机械剥离方式，其过程中对细胞片层及细胞外基质造成了一定的机械损伤，从而使细胞外基质超微结构发生一定变化，最终影响后续对其它细胞的增殖分化的促进作用。

本发明在近年来的报道的光致细胞薄层获取技术基础上，开发了一种经由细胞薄层获取细胞外基质薄膜的方法。该方法利用光致细胞薄层脱附技术能够获得具有细胞外基质含量高、活性功能良好的细胞薄层的特点[Y.Hong,M.F.Yu,W.J.Weng,K.Cheng,H.M.Wang,J.Lin.Light-induced cell detachment for cell sheettechnology.Biomaterials,2013,34(1):11-18]，将之通过一系列的处理形成了一种具有高活性的细胞外基质薄膜。该方法获得的细胞外基质薄膜保持了原有的超微结构和组成成分，并具有良好的韧性，可应用于组织工程等领域。这意味薄层中的细胞具有良好的活性。

同时，磷酸钙材料也是一种广泛应用于组织修复的材料。有鉴于此，本发明开发一种将细胞薄层磷酸钙复合后得到磷酸钙/细胞外基质复合薄膜的方法。本发明的制备方法，工艺简单，易于实现，有利于进行推广应用，所得到的复合薄膜具有良好的生物相容性和组织修复特性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种经由细胞片层获得磷酸钙/细胞外基质薄膜的方法。

制备上述的细胞外基质薄膜的方法，包括如下步骤：

(1)对可光致细胞脱附的细胞培养表面进行灭菌处理；

(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800～1300r/min离心2～6min后，用DMEM培养基混悬，并用计数器计数，以1×10⁵～1×10⁶细胞密度将细胞接种于细胞培养表面上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，2～4天后进行第一次换液，之后每2～3天换液一次，整个培养周期5～10天，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；