[发明专利]一种滋养细胞刺激NK细胞扩增的方法和用途

说明书

本发明属于生物技术领域。本发明公开了表达CD64、CD86、41BBL和mbIL‑21滋养细胞(K562‑APC3‑mbIL21)的构建方法和序列信息。同时也公开了此滋养细胞刺激NK细胞扩增的整个流程和应用的领域。本发明制备的滋养细胞能够提高NK细胞的体外扩增效率同时也能使NK细胞保持高纯度的状态。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基因工程改造的滋养细胞来刺激NK细胞的扩增方法和用途。

背景技术

NK(Natural Killer)细胞-自然杀伤细胞，属于非特异性免疫细胞，表面的标志主要有CD56、CD16等。健康人外周血中，约占淋巴细胞总数的5～15％。为机体抵抗肿瘤的第一道防线，通常处于休眠状态，信号因子激活后，会渗透到组织中攻击肿瘤细胞和病毒感染细胞。

NK细胞活性与与肿瘤发病呈负相关性。NK细胞活性随着年龄的增加逐渐降低，癌症发病率随着年龄的增长而增高；NK活性低的人群组要比NK活性中、高组的癌症发病率高两倍；癌症患者体内NK细胞表现为激活性受体(KAR)表达降低，抑制性受体(KIR)表达增加，从而功能受到抑制；癌症转移病人的NK活性明显降低。

NK细胞具有较广的抗瘤谱。可杀伤同系、同种或异种肿瘤细胞，其杀伤靶细胞的机制可能是1)释放穿孔素和颗粒酶引起靶细胞坏死或凋亡；2)通过死亡受体调节诱导靶细胞凋亡；3)分泌多种效应性细胞因子对抗转移肿瘤；4)激发继发肿瘤免疫反应。

NK细胞是固有免疫系统中淋巴细胞，它不能识别外源抗原分子，但是能够杀伤肿瘤细胞及病毒感染的细胞[Front Immunol,2014,17,5:95.]。对肿瘤病人进行过继NK细胞治疗有很大前景。因为NK细胞具有很高的杀伤活性且不会产生移植物抗宿主反应。唯一的遗憾是没有足够的NK细胞用于免疫治疗[Tumors Front Immunol,2014,5:87.]。所以体外扩增NK细胞技术就应运而生，逐步开始发展[Blood,2005,106(1):376-383.]。研究发现，综合使用各种细胞因子或许在体外、体内有助于NK的增殖及效应功能[Cytokine,2013,62(1):58-63.]。γ链细胞因子在NK细胞增殖及功能发挥上均发挥了重要作用。该家族成员包括IL2、IL4、IL7、IL9、IL15和IL21。在NK细胞分化过程中，不同的细胞因子都具有不同的作用[J Biomed Biotechnol,2011,2011:861920.]。

自然杀伤(NK)细胞可以通过增殖细胞因子(例如IL-2和IL-15)激活后扩增。NK细胞通过来自饲养细胞(肿瘤细胞系和PBMC)分泌的一些蛋白质扩增能力大大增强。因此，辐照的饲养细胞和NK细胞的共培养系统的培养基包含IL-2和IL-15，此共培养系统已被开发以产生大量的NK细胞。常用的饲养细胞系是RPMI8866，Epstein-Barr淋巴样细胞系(EBV-LCL)和K562。已知NK-敏感K562细胞(基因工程修饰后的细胞)的刺激增加NK细胞对IL-2，IL-15和IL-21的组合培养系统增殖反应能力(Methods Mol Biol.2016；1441:167-74.)。IL21是NK细胞功能的重要调节分子，能够促进NK细胞增殖，增强NK细胞毒性作用及ADCC作用[Nature,2000,408(6808):57-63.]。近年来，有人采用基因工程的方法在K562细胞上同时表达IL-15、CD137L等分子，并以此细胞来刺激NK细胞的增殖。IL-15和CD137L联合刺激是PBMC中NK细胞特异性扩增的基础：作为膜蛋白，通过细胞间的接触刺激，用以诱导NK细胞扩增。IL15能够促进NK细胞的分化成熟，而IL21能够联合IL15分子促进NK细胞的分化成熟[Nature.408(6808):57-63.]

NK细胞在外周血淋巴细胞中所占的比例较低，所以有必要建立一种NK细胞体外扩增技术，用于研究NK细胞的功能，并为肿瘤细胞免疫治疗奠定基础。