[发明专利]一株鸭疫里默氏杆菌基因缺失弱毒株及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一株鸭疫里默氏杆菌基因缺失弱毒株及其构建方法与应用，该菌株是Riemerella anatipestifer CH‑1ΔB739_1343，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:M2016438，缺失了血红素转运系统B739_1343基因的2352bp，所缺失的基因序列如SEQ ID NO.1所示。动物实验结果表明缺失株的LD₅₀值大于10¹⁰CFU，RA‑CH‑1的LD₅₀值约为10⁸CFU；缺失株对雏鸭的致病力下降了至少100倍。该弱毒株对剂量>100×LD₅₀的野生强毒株RA‑CH‑1的攻毒保护率达83.33％，可作为RA基因缺失疫苗的候选菌株。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一株鸭疫里默氏杆菌基因缺失弱毒株及其构建方法与应用。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的一种主要侵染雏鸭等多种禽类的急性或慢性的接触性传染病。该病分布范围广，已成为严重危害养鸭业的细菌性传染病之一。目前，我国控制该病的主要措施是疫苗预防和药物治疗。由于鸭疫里默氏杆菌存在多种血清型且各血清学之间无交叉保护作用，所以一种疫苗只能针对一种血清型起作用。而药物的大量使用导致RA的耐药性不断增强，同时也给食品造成了安全隐患。所以研制预防RA病的新型疫苗是未来的发展方向。

铁元素是绝大多数生物体生长所必需的营养元素，包括细菌。然而，宿主通过“营养免疫”机制极大地限制了铁的可利用度。因此病原菌必须拥有铁转运机制才能成功感染宿主。相反，如果病原菌铁离子利用系统遭到损伤，则感染宿主的能力减弱。利用此原理可以产生鸭疫里默氏杆菌弱毒株并用于免疫预防。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一株鸭疫里默氏杆菌基因缺失弱毒株及其构建方法与应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一株鸭疫里默氏杆菌基因缺失弱毒株，该菌株是鸭疫里默氏杆菌CH-1ΔB739_1343，命名为Riemerella anatipestifer CH-1ΔB739_1343，于2016年8月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:M2016438，该菌株缺失了血红素转运系统B739_1343基因的2352bp，所缺失的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还公开了一种鸭疫里默氏杆菌基因缺失弱毒株的构建方法，包括以下步骤：

1)PCR扩增RA-CH-1B739_1343基因左右同源臂及Spec抗性基因；

2)将扩增好的RA-CH-1B739_1343基因左右同源臂及Spec抗性基因进行酶切并连接过夜，构建B739_1343-LSR片段；

3)构建重组自杀性质粒pEX18GMΔB739_1343-LSR；

4)构建RA-CH-1B739_1343基因缺失株，RA-CH-1B739_1343基因缺失株即为鸭疫里默氏杆菌基因缺失弱毒株。

进一步地，步骤1)中PCR扩增RA-CH-1B739_1343基因左右同源臂及Spec抗性基因具体为：

1.1)根据B739_1343基因左右同源臂设计两对引物B739_1343-L F/R和B739_1343-R F/R，并在引物5’-端添加限制性内切酶酶切位点；利用RA-CH-1基因组作为模板，分别以B739_1343-L F/R和B739_1343-R F/R为引物扩增B739_1343基因左右同源臂片段B739_1343-L和B739_1343-R；PCR条件为：98℃变性30s，经98℃10s，55℃30s，72℃30s循环扩增30次，72℃延伸7min；