[发明专利]一种颅骨光透明处理方法及其应用

说明书

本发明提供了一种颅骨光透明处理方法及其应用，所述处理方法包括如下步骤：将骨密质疏松处理剂加入到颅骨表面进行处理，所述骨密质疏松处理剂选自胶原蛋白酶、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸二钠；清洗所述骨密质疏松处理剂处理后的颅骨表面；在清洗后的颅骨表面加入高折射率的水溶性试剂进行处理，得到折射率相对均一的颅骨。经本发明处理后的颅骨组织变得透明，可以用于活体双光子显微成像中，实现对皮层神经和微脉管结构进行高分辨成像。

技术领域

本发明属于生物医学光学成像技术领域，尤其涉及一种颅骨光透明处理方法及其应用。

背景技术

对皮层细胞的长期观察和操纵对于研究神经元、胶质细胞和微脉管系统具有重要的意义，随着转基因技术和双光子显微成像的发展，科学家们可以在活体哺乳动物水平对皮层进行长期重复成像，进而理解神经系统复杂的环境。尤其是追踪单个突触的命运，进而研究感觉经验、学习与记忆对树突棘动态变化的调控。

然而由于皮层上方颅骨的高散射特性，使得颅骨变得非常浑浊，进行深部脑成像时光子难以实现聚焦，为解决这一问题，研究者主要发展了不同的颅窗，第一种是采用颅骨切开术，将一部分颅骨完全移除并用盖玻片覆盖暴露的脑膜，由于不可避免地暴露脑，改变了皮层的理化性质、引起了不同程度的炎症反应，影响了实验数据的可靠度和可信度；第二种是采用颅骨磨薄手术，将颅骨打磨到小于25μm的厚度，此种手术操作非常困难；第三种是将两种手术结合，将颅骨打磨到约10-15μm，再用盖玻片覆盖，但是这种颅窗主要用于对皮层微脉管的研究中。正是由于这些颅窗技术本身存在的这些不足，加之手术过程较复杂、手术难度大、对实验人员操作要求高等因素，严重限制了皮层神经成像的研究。

发明内容

针对现有技术中的上述缺陷，本发明的主要目的在于提供一种简单安全的颅骨光透明处理方法及其应用，经处理后的颅骨组织变得透明，可以用于活体双光子显微成像中，实现对皮层神经和微脉管结构进行高分辨成像。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种颅骨光透明处理方法，所述处理方法包括如下步骤：

将骨密质疏松处理剂加入到颅骨表面进行处理，所述骨密质疏松处理剂选自胶原蛋白酶、胰蛋白酶及乙二胺四乙酸二钠；

清洗所述骨密质疏松处理剂处理后的颅骨表面；

在清洗后的颅骨表面加入高折射率的水溶性试剂进行处理。

作为进一步的优选，所述骨密质疏松处理剂的浓度为2％-20％，所述骨密质疏松处理剂的的处理时间为5-7min。

作为进一步的优选，所述清洗采用清洗剂，所述清洗剂选自水、二甲基亚砜和无水乙醇。

作为进一步的优选，所述二甲基亚砜和无水乙醇的浓度为50％-100％，所述清洗剂的处理时间为2-3min。

作为进一步的优选，所述水溶性试剂选自果糖、蔗糖、丙三醇及山梨醇。

作为进一步的优选，所述水溶性试剂的浓度为50％-100％，处理时间为3-5min。

作为进一步的优选，所述颅骨包括小鼠颅骨。

一种颅骨光透明处理方法的应用，将所述处理方法处理过的颅骨用于双光子显微成像。

作为进一步的优选，所述双光子显微成像包括：采用薄膜将所述处理方法处理过的颅骨表面的溶剂隔开，放入水镜下进行成像。

作为进一步的优选，所述薄膜包括氰基丙烯酸薄膜。

本发明的有益效果是：