[发明专利]一种生产核黄素的工程菌株及其应用

说明书

本发明提供了一种生产核黄素的工程菌株及其应用。具体地，本发明提供了一种通过基因修饰(基因敲除或基因整合)获得的工程细菌，包括对核黄素合成基因及其启动子的改造，该菌株表现出稳定的核黄素生产能力，可以用于核黄素的生产。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种生产核黄素的工程菌株及其应用。

背景技术

核黄素(Riboflavin)，即维生素B2(VB2)，是一种水溶性的B族维生素，为黄素酶类的辅酶组成部分，在呼吸和生物氧化中起着重要的作用，是人类和动物必需的一种维生素，主要应用于医药、食品及饲料工业作为食品、饲料添加剂和食用天然色素等。

二十世纪七十年代前，微生物发酵法生产核黄素主要以棉囊阿舒氏酵母(Ashbyagossypii)、解朊假丝酵母(Candida famata)、阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)等真菌为主。相继构建成功的Bacillus subtilis等产核黄素工程菌，因其具有发酵周期短、原料价廉易得、原核细胞基因工程技术成熟等优点，成为重点研究对象。此外，在芽孢杆菌属中，包括Bacillus subtilis在内的许多菌株具有可靠的安全性，它们的发酵产物在食品与饲料工业中已有长期的应用。

目前传统的核黄素生产菌改造方法是进行菌种诱变，比如物理诱变，化学诱变等。物理诱变、化学诱变的方法进行菌种改造，随机性比较大，造成筛选工作量巨大，耗时长，见效慢。而且菌株基因的遗传稳定性差，传代过程中基因可能恢复突变，造成菌种核黄素合成能力下降。因此，本领域迫切需要构建稳定、高产的核黄素生产菌，从而进行核黄素生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定、高产的核黄素生产菌及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种生产核黄素的工程菌株，所述菌株为芽孢杆菌(Bacillus)，并且所述菌株的基因组中整合有外源基因表达盒，所述的外源基因表达盒含有以下元件：P15启动子和核黄素操纵子基因。

在另一优选例中，所述的外源基因表达盒包含第一外源基因表达盒和第二外源基因表达盒。

在另一优选例中，所述的第一外源基因表达盒还含有AmyE基因元件。

在另一优选例中，所述的AmyE基因包括AmyE基因片段。

在另一优选例中，所述的AmyE基因片段为AmyE基因5’端的长度为600bp的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的第一外源基因表达盒整合于所述工程菌株基因组的AmyE基因下游。

在另一优选例中，所述的第一外源基因表达盒和第二外源基因表达盒还含有抗性基因元件。

在另一优选例中，所述的第一外源基因表达盒含有的抗性基因元件与第二外源基因表达盒含有的抗性基因元件不同。

在另一优选例中，所述抗性基因选自下组：四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氨苄霉素抗性基因、或其组合。

在另一优选例中，所述的外源核黄素操纵子基因选自下组：ribB基因、ribG基因、ribA基因、ribH基因、ribTD基因、或其组合。

在另一优选例中，所述的工程菌株是经原生质体融合获得的重组子。

在另一优选例中，所述菌株的基因组中外源基因(核黄素操纵子基因)的拷贝数为10-50个，较佳地为20-40个。

在另一优选例中，所述菌株的基因组中整合有10-50个，较佳地20-40个所述的外源基因表达盒。

在另一优选例中，所述菌株的基因组中整合有30-50个拷贝的ribG基因。