[发明专利]改善的FLARE(流式细胞术减弱报道蛋白表达)技术用于快速批量分选

说明书

本文提供了使用荧光激活的细胞分选(FACS)分批生产生产者细胞的方法和组合物。在一些方面，本公开提供了使用FACS分批生产生产者细胞的无药物选择方法。这样的分批生产方法和组合物可进一步用来生成生产者细胞的克隆群体，例如，用于大规模制造感兴趣的多肽。

相关申请

本申请要求于2015年10月9日提交的美国临时专利申请号62/239,515的优先权的权益。前述申请的内容通过提及以其整体由此并入。

背景技术

用于选择生产者细胞群体和细胞克隆的方法对制造生物制剂如抗体和融合蛋白是必要的。这样的方法通常依靠选择剂如甲氨喋呤(MTX)或甲硫氨酸砜亚胺(MSX)的使用，以偏置和扩增生物制剂的产生。基于选择剂的方法可能影响选择的群体的存活力或生长速率，或可能对克隆稳定性具有负面影响。这样基于药物的选择还可能是耗费时间的，经常需要多轮选择以获得含有适合于生物制造的克隆的群体。这仍然需要生成产生高效价生物制剂和对宿主较小负面影响的大细胞群体和克隆的快速和可靠的方法。

发明内容

在一些方面，本公开提供了生产者细胞的分批选择和克隆选择的方法。如本文所述，开发用于分批选择的方法，其依赖于使用荧光激活的细胞分选(FACS)而不使用MTX作为扩增剂的生产者细胞的异质群体的快速批量分选。令人惊奇地发现本文所述的方法比传统MTX扩增更快且更有效。本文所述的方法例如对生成用于筛选感兴趣的多肽(如在早期临床开发中)和用于生成高效价克隆的生产者细胞的有效汇集物是有用的，其可用于产生用于小规模和大规模制造的感兴趣的多肽。

因此，在一些方面，本公开提供了一种荧光激活的细胞分选(FACS)以分批选择表达靶多肽的生产者细胞的方法，所述方法包括(a)提供生产者细胞的异质群体，其中所述群体中的所述生产者细胞表达不同水平的由相同多顺反子mRNA编码的FACS可选多肽和靶多肽，(b)使用FACS从所述生产者细胞的异质群体选择生产者细胞的第一异质亚群，其中，所述第一异质亚群中的所述生产者细胞以高于(a)中所述异质群体中的所述生产者细胞的至少80％的水平的水平表达FACS可选多肽，和(c)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第一异质亚群，由此产生生产者细胞的扩大的第一异质亚群。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括(d)使用FACS从步骤(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群选择生产者细胞的第二异质亚群，其中所述第二异质亚群中的所述生产者细胞以高于(c)中所述生产者细胞的扩大的异质亚群中的所述生产者细胞的至少80％的水平的水平表达FACS可选多肽，和(e)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第二异质亚群，由此产生生产者细胞的扩大的第二异质亚群。

在提供的方法的任一个的一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述扩大的第一或第二异质亚群分离所述靶多肽。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述扩大的第一或第二异质亚群分离一个或多个单个生产者细胞，并且单独地培养所述一个或多个单个生产者细胞以产生所述一个或多个单个生产者细胞的克隆群体。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，与(a)中所述生产者细胞的异质群体的情况相比，所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群在所述靶多肽产生中得到1.2至5倍改善。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，与(c)中所述生产者细胞的扩大的异质亚群的情况相比，所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群在所述靶多肽产生中得到1.2至2.5倍改善。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，与(a)中所述生产者细胞的异质群体的情况相比，所述一个或多个单个细胞的至少一个克隆群体在所述靶多肽产生中得到5至30倍改善。

在提供的方法的任一个的一些实施方案中，在(b)中经受FACS的所述生产者细胞的异质群体含有80-120x 10⁶个细胞。在提供的方法的任一个的一些实施方案中，在步骤(c)或(e)中的扩大之前，所述生产者细胞的第一和/或第二异质亚群含有0.5-6.0x 10⁶个细胞。