[发明专利]改善的FLARE(流式细胞术减弱报道蛋白表达)技术用于快速批量分选

权利要求书

1.一种荧光激活的细胞分选(FACS)以分批选择表达靶多肽的生产者细胞而不使用甲氨喋呤(MTX)作为扩增剂的方法，所述方法包括：

(a)提供生产者细胞的异质群体，其中所述群体中的所述生产者细胞表达不同水平的由相同多顺反子mRNA编码的FACS可选多肽和靶多肽，

(b)使用FACS从所述生产者细胞的异质群体选择生产者细胞的第一异质亚群，其中，所述第一异质亚群中的所述生产者细胞以高于(a)中所述异质群体中的所述生产者细胞的至少80％的水平的水平表达FACS可选多肽，和

(c)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第一异质亚群，由此产生生产者细胞的扩大的第一异质亚群。

2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：

(d)使用FACS从步骤(c)中的所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群选择生产者细胞的第二异质亚群，其中所述第二异质亚群中的所述生产者细胞以高于(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群中的所述生产者细胞的至少80％的水平的水平表达FACS可选多肽，和

(e)在无药物选择培养基中扩大所述生产者细胞的第二异质亚群，由此产生生产者细胞的扩大的第二异质亚群。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括从生产者细胞的所述扩大的第一或第二异质亚群分离所述靶多肽。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括从生产者细胞的所述扩大的第一或第二异质亚群分离一个或多个单个生产者细胞，并且单独地培养所述一个或多个单个生产者细胞以产生所述一个或多个单个生产者细胞的克隆群体。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，与(a)中所述生产者细胞的异质群体的情况相比，所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群在所述靶多肽产生中得到1.2至5倍改善。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，与(c)中所述生产者细胞的扩大的第一异质亚群的情况相比，所述生产者细胞的扩大的第二异质亚群在所述靶多肽产生中得到1.2至2.5倍改善。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中，与(a)中所述生产者细胞的异质群体的情况相比，所述一个或多个单个生产者细胞的至少一个克隆群体在所述靶多肽产生中得到5至30倍改善。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，在(b)中经受FACS的所述生产者细胞的异质群体含有80-120x 10⁶个细胞。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)或(e)中的扩大之前，所述生产者细胞的第一和/或第二异质亚群含有0.5-6.0x 10⁶个细胞。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，步骤c)中的所述扩大进行7-14天。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，步骤e)中的所述扩大进行7-14天。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述无药物选择培养基为无甲氨喋呤培养基或无甲硫氨酸砜亚胺(methionine sulphoximine)培养基。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，通过用编码所述多顺反子mRNA的载体转染细胞和使转染的细胞经受一轮基于培养基的选择以选择表达不同水平的所述多顺反子mRNA的细胞来产生(a)中所述生产者细胞的异质群体。

14.根据权利要去13所述的方法，其中，所述载体进一步含有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。