[发明专利]使核酸移位通过纳米孔的方法

说明书

本发明提供了使用允许单链多核苷酸但不允许双链多核苷酸通过的纳米孔用于分析多核苷酸的方法。根据一些实施方案，产生包含具有单链尾部或突出端的标记的链的双链产物。在跨一个或更多个纳米孔的电场存在下，将双链产物暴露于一个或更多个纳米孔，使得单链尾部可以被捕获并且标记的链从双链产物解链并被移位。选择反应混合物的离子组成和电场强度，以便核苷酸以小于1000个核苷酸/秒的速率移位通过纳米孔。

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年12月8日提交的美国临时申请第62/264,727号和2016年8月10日提交的美国临时申请第62/372,928号的优先权，这两个申请通过引用以其整体并入本文。

背景

经过过去十年开发的DNA测序技术已经使生物科学发生了革命性变化，例如vanDijk等人，Trends in Genetics,30(9):418-426(2014)。然而，要实现该技术的全部潜力仍然存在许多挑战，包括减少每次运行测序成本、简化样品制备、缩短运行时间、增加序列读段长度、改进数据分析等。单分子测序技术，例如基于纳米孔的测序，可以解决这些挑战中的一些；然而，这些方法具有它们自身的一组技术难题，例如可靠的纳米结构制造、DNA移位速率的控制、核苷酸辨别、来自大的纳米孔传感器阵列的电信号的检测等，例如Branton等人,Nature Biotechnology,26(10):1146-1153(2008)。特别地，已经提出了许多解决方案来控制DNA移位速率，所述解决方案范围从增加粘度到添加分子马达和/或DNA“棘轮”结构到纳米孔。不幸地，这些针对移位问题的方法呈现出严重的关于样品制备的简单性、装置制造的容易性、检测灵敏度等的让步(trade-offs)。

鉴于上述情况，如果方法可用于方便地且有效地制备用于使用纳米孔移位和分析的核酸靶分子，则对于一般性纳米孔传感器技术以及其特定应用例如基于光学的纳米孔测序将是有利的。

发明概述

本发明涉及用于制备用于通过纳米孔移位和分析的多核苷酸靶分子的方法。

在一个方面中，本发明涉及制备包括标记的链的双链DNA产物，所述标记的链包括能够被纳米孔捕获以引发移位的单链突出端。

在另一方面中，本发明涉及一种分析核酸的方法，该方法包括以下步骤：(a)在反应混合物中使具有5'非互补尾部的引物在模板上延伸以产生包含延伸链和作为单链突出端的5'非互补尾部的双链产物；(b)提供分隔第一室和第二室并提供在第一室和第二室之间的流体连通的纳米孔，其中所述纳米孔能够使单链核酸而不是双链核酸通过；(c)将双链产物布置在第一室中；(d)通过施加跨纳米孔的电场，使双链产物的5'非互补尾部被纳米孔捕获；和(d)通过所施加的电场以可检测的速率使捕获的双链产物的标记的延伸链移位通过纳米孔，其中随着双链产物的移位链进入纳米孔，双链产物的移位链被解链或呈单链。在一些实施方案中，本发明的方法还包括在将双链产物布置在第一室中之前从延伸反应混合物中分离双链产物的步骤。

还在另一个方面中，本发明涉及一种分析核酸的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在反应混合物中使引物在模板上延伸以产生包含具有游离的3'-羟基的标记的延伸链的双链产物；(b)通过末端转移酶活性在无模板的情况下进一步延伸所述延伸链以在双链产物上产生3'-单链尾部；(c)提供分隔第一室和第二室并提供在第一室和第二室之间的流体连通的至少一个纳米孔，其中至少一个纳米孔的每个纳米孔能够使单链核酸而不是双链核酸通过；(d)将具有3'单链尾部的双链产物布置在第一室中；(e)通过施加跨纳米孔的电场，使双链产物的3'单链尾部被至少一个纳米孔捕获；(f)通过所施加的电场以小于1000个核苷酸/秒(nt/sec)的速率使捕获的双链产物的标记的延伸链移位通过纳米孔，其中随着双链产物的移位链进入纳米孔，双链产物的移位链被解链。