[发明专利]人IgG1结合多聚抗原的直接亲和力测量

说明书

本文报道用于测定人IgG1亚类二价全长抗体的结合部位与同多聚抗原的结合亲和力的方法，其包括步骤：i)在从pH7.5至pH 8.5的pH下、在还原剂存在下、在从30℃至42℃的温度下，孵育包含抗体和衍生自牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶的多肽的混合物10分钟至240分钟的时间，以将抗体切割为Fab和Fc区；和(ii)通过将前面步骤中获得的孵育反应混合物直接应用在表面等离振子共振法中，用表面等离振子共振法测定抗体Fab对其抗原的结合亲和力，从而测定人IgG1亚类二价全长抗体的结合部位的结合亲和力。

本文报道用表面等离振子共振测定人IgG1结合二聚体抗原或多聚抗原的亲和力常数的快速便捷方法。该方法基于牙龈卟啉单胞菌 (porphyromonas gingivalis)的赖氨酸牙龈菌蛋白酶(gingipain)的高特异性和定量消化，产生完整Fab和Fc片段的同质混合物而无任何通常与其他蛋白水解酶相关的片段的过度消化。

背景技术

除其作用外，生物制药产品的质量具有决定性的重要性。因此，为了安全地将它们用作治疗剂，除详细研究作用方式外，绝对有必要测定基于蛋白质的药物的同一性、纯度和活性。

虽然mAb可通过多种分离手段和测试技术成功分析，但长期难以应用和优化RP-HPLC法(RP-HPLC，反相高效液相色谱)来分离抗体种类。但是，降解过程中常同时存在抗体的多种修饰，这使得更难以分析多种多样的色谱和电泳条带。利用液相色谱分离方法偶联高分辨率质谱仪 (LC/MS，液相色谱/质谱分析法)的分析产生关于多种种类的精确质量的信息，因此便于鉴定抗体变体(Dillon,T.M.等,J.Chromatogr.A,1053(2004) 299-305)。

木瓜蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)相对非特异地在精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、甘氨酸(G)和酪氨酸(Y)后切割肽键。如果孵育期足够长，木瓜蛋白酶消化导致完全水解。但是，抗体可通过有限蛋白酶解相对选择性地在其铰链区中切割(Lottspeich,F.和Engels,J.W., “Bioanalytik Spektrum Akademischer Verlag”Munich2nd Edition(2006) 201-214)。切割发生在将两条重链连接在一起的二硫键的N端侧。二硫键在此过程中得以保留，使得在消化后获得三个片段(2个Fab片段，1个Fc 片段)。两个N端片段称为抗原结合片段(Fab，抗原结合片段)，C端片段称为结晶片段(Fc，结晶片段)。每个Fab片段由完整轻链和氨基端一半的重链组成。Fc片段由仍通过二硫键连接在一起的两个羧基端一半的重链组成。

近年来，鉴定出了不同的IgG特异性蛋白酶。

WO 2015/40125中报道了链球菌红斑毒素B(SpeB)。将它描述为来自酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)的半胱氨酸蛋白酶，显示它在铰链区中将IgG切割为两个稳定的单体Fab片段和一个Fc片段。进一步报道SpeB 在Kabat编号系统的238和239位(EU编号系统的225和226位)之间切割 IgG的铰链区。

来自人病原体酿脓链球菌的也称为Mac-1或sib-38的半胱氨酸内切蛋白酶IdeS(免疫球蛋白降解酶S)是特异性切割免疫球蛋白G型(IgG)抗体重链的半胱氨酸蛋白酶。IgG是迄今唯一已知的IdeS底物(Vincents,B.等, Biochem.43(2004)15540-15549)。IdeS由339个氨基酸组成，包括含有29 个氨基酸的信号肽(von Pawel-Rammingen,U.等,EMBOJ.21(2002) 1607-1615)，其中氨基酸214至216形成RGD基序。IdeS在铰链区中Kabat 编号系统的249和250位(EU编号系统的236和237位)(包含在识别序列 LLGGP中的Gly-Gly)之间切割人IgG(G类免疫球蛋白)。在识别基序 PVAGP中的氨基酸丙氨酸和甘氨酸之间切割人IgG2。还切割IgG2a和 IgG3类型的鼠抗体(Vincents,B.等,Biochem.43(2004)15540-15549)。