[发明专利]细胞的早期转染后分离(EPIC)用于生物制品产生

说明书

本文提供的是用于选择表达靶多肽的细胞的群体的方法。在一些方面，本公开提供了基于转染的宿主细胞的群体的可选多肽的早期表达，用于分选和选择方法。在某些实施方案中，基于所述可选多肽，分选使用荧光激活的细胞分选或磁性激活的细胞分选进行。这样的选择方法可进一步用来生成生产者细胞的克隆群体，例如用于感兴趣的靶多肽的大规模制造。

相关申请

本申请要求于2015年10月9日提交的美国临时专利申请号62/239,515的优先权的权益。在先申请的内容通过提及以其整体由此并入。

背景技术

用于选择生产者细胞群体和细胞克隆的方法对制造生物制品如抗体和融合蛋白是必要的。这样的方法通常依赖于选择剂如甲氨喋呤(MTX)或甲硫氨酸砜亚胺(methioninesulphoximine,MSX)的使用，以偏好和放大生物制品的产生。基于选择剂的方法可影响选择的群体的存活力和生长速率，或可对克隆稳定性具有负面影响。这样的基于药物的选择也可为耗费时间的，经常需要多轮选择，以获得含有适合于生物制剂制造的克隆的群体。这仍然需要快速且可靠的生成产生高效价和对宿主细胞的负面影响较小的生物制剂的克隆和大细胞群体两者的方法。

发明内容

在一些方面，本公开提供了选择表达靶多肽的细胞的群体的方法。如本文所述，依赖于群体转染后不久的分选，开发了用于选择的方法。因此，该方法的特征在于分离转染的细胞的亚群用于转染的载体的早期可检测表达的步骤。在某些实施方案中，选择是基于可选多肽的早期表达，所述可选多肽不同于靶多肽，而且是在细胞的表面上可检测的。

意想不到地，发现本文所述的方法比使用两轮MTX选择来产生汇集物的传统方法更快，并且比包括单轮MTX选择的传统MTX扩增更高效。

本文所述的方法例如对生成用于筛选感兴趣的多肽的细胞的汇集物(如在早期临床发展中)和对生成高效价克隆是有用的，其可用来产生用于小规模和大规模制造的感兴趣的多肽。

因此，在一些方面，本公开提供了产生表达靶多肽的生产者细胞的群体的方法，所述方法包括：(a)用编码一个或多个mRNA的一个或多个载体转染宿主细胞，其中所述一个或多个mRNA编码可选多肽和所述靶多肽；(b)在转染后的2至15天内，从所述转染的宿主细胞分离表达所述可选多肽的早期表达转染的宿主细胞的亚群；和(c)扩大所述早期表达的转染的宿主细胞的亚群，由此产生生产者细胞的群体。

在一些实施方案中，所述步骤(b)在无药物选择培养基中进行。

在一些实施方案中，所述步骤(c)在无药物选择培养基中进行。

在一些实施方案中，所述步骤(b)和(c)各自在无药物选择培养基中进行。

在提供的任一方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括从扩大的亚群中分离所述靶多肽。

在提供的任一方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述扩大的亚群中分离一个或多个单一转染的宿主细胞，和培养所述一个或多个单一转染的宿主细胞以产生一个或多个单一转染的宿主细胞的克隆群体。

在提供的任一方法的一些实施方案中，与在步骤(c)中获得的转染但未克隆的宿主细胞的稳定的汇集物相比，所述一个或多个单一转染的宿主细胞的克隆群体的至少一个在靶多肽产生中得到2至30倍改善。

在提供的任一方法的一些实施方案中，在步骤(b)中经过分离的转染的宿主细胞含有至少80-120x 10⁶个细胞。

在提供的任一方法的一些实施方案中，所述步骤(b)中的分离在转染后少于6天进行。在提供的任一方法的一些实施方案中，所述步骤(b)中的分离在转染后2-4天进行。在提供的任一方法的一些实施方案中，所述步骤(b)中的分离在转染后2天进行。在提供的任一方法的一些实施方案中，所述步骤(b)中的分离在转染后3天进行。