[发明专利]作为用于显微术和荧光成像的基准标记的荧光纳米金刚石

说明书

公开了包含荧光纳米金刚石的基准标记组合物以及制造和使用该基准标记组合物的方法。基准标记组合物包含基底和固定在基底的表面上的荧光纳米金刚石，其中，基底和固定的荧光纳米金刚石可选地顶涂覆有惰性顶部涂层。基准标记组合物在成像方法中使用以校准漂移和其他对准不稳定性，并且在超分辨率成像中特别有用。

相关申请的引用

本申请要求于2015年12月2日提交的美国临时专利申请序列号62/262,058的权益，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

基准标记在各种类型的成像系统中的载玻片或样品上提供稳定的固定点。所有的测量参考这些点来消除样品漂移。

现有的基准标记基于金纳米颗粒、荧光标记的纳米尺度的珠粒以及不太常见的量子点。所有这三种基准标记都有多个限制。

目前最常使用的基准标记是金纳米颗粒，其可以从许多来源例如Hestzig LLC商购获得。在这种方法中，金纳米颗粒被嵌入玻璃盖玻片中。金颗粒表现出依赖于大小和形状的发射，其不会随着时间而变白。

然而，金纳米颗粒基准标记具有多个缺点：它们具有窄的发射(光致发光)波长，其与颗粒的大小有关。由于发射波长、发射强度和颗粒大小被耦合，所以难以控制金颗粒的发射。因此，在不改变发射波长的情况下调整发射强度可能是困难的。另外，金可以表现出依赖于偏振的发射强度。很难获得多个波长的相关性。此外，金颗粒会随着时间而闪烁。

染料标记的纳米尺度珠粒例如TetraSpeck珠粒(LifeTechnologies，目录#T7279)是另一种较少使用的基准标记。优点是尺寸小(100nm)，并且并入了涵盖大范围的发射波长的四种不同的染料。这些珠粒的关键限制是它们随着时间而漂白，限制了它们在扩展成像试验中的用途。

量子点作为基准标记而使用得少得多。虽然它们是明亮的荧光探针，但它们经受闪烁、发射波长窄、它们的发射强度难以调节，并且它们随着长的时间段而漂白。因此，它们通常太明亮而不能用于其中测量的荧光团相当暗的许多应用，并且它们不适合于在延长的时间段内的跟踪应用。

尽管有传统荧光显微镜的优点，但由于光衍射所决定的分辨率极限，这限制了可以用标准物镜捕获的信息量，因此这种技术在超微结构研究中受到阻碍。光显微镜的分辨率极限被统称为超分辨率显微镜的技术超过。

近来已经开发了各种超分辨率显微镜技术以克服光显微镜的衍射极限，使得实现小分子结构的可视化。其中，称为单分子定位显微镜(SMLM)的一类超分辨率技术包括光激活定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM)，实现了最高水平的成像精度(10-20nm)。SMLM技术具有通用的荧光探针，其可以在开启(荧光)和关闭(暗/光切换)状态之间切换，从单个分子中分离荧光，以及顺序定位高斯拟合的荧光峰。

由于其兼容商业染料和显微镜，直接STORM(dSTORM)已成为广泛采用的SMLM技术。另外，与利用PALM实现的约20nm相比，dSTORM可以常规地实现约10nm的定位精度。然而，尽管定位精度很高(通常使用汤普森方程计算)，但使用SMLM精确定位单分子已经受到许多问题的阻碍。首先，“定位精度”通常与“定位准确性”混淆(例如，10nm精度的高斯拟合峰被错误地假定为在荧光探针的真实位置的10nm内)。这具有如下重要的后果：5-10nm的定位精度(通过大多数dSTORM研究实现)不足以以高置信度准确定位单个分子。其次，通过包括漂移和振动的显微镜台运动引入附加的定位不确定性。