[发明专利]用于低温保存的方法

说明书

本发明涉及低温保存的方法和用于这样的方法的组合物，其中该方法利用低温保存介质的非牛顿流体性质来调节该介质的粘度以提供改进的低温保存过程。

发明领域

本发明涉及用于低温保存生物样品的无冰方法、用于这样的方法的组合物、包含供使用的该组合物的包以及通过该新颖方法保存的样品。

发明背景

低温保存是用于保存生物样品的技术，其包括将样品冷却至非常低的温度并且将该样品保持在非常低的温度持续延长的时间段，该非常低的温度例如-80℃、-136℃或-196℃。通过将生物样品冷却至低温，将以其他方式降解样品的化学反应或酶促反应的动力学被减慢至使得样品不再降解或仅以非常慢的速率降解的程度。因此，可以将生物样品储存延长的时间段，并且然后返回到如用于使用和/或分析所需要的环境温度。

然而，冷却过程可能对生物样品具有不利影响，并且为了减轻这些影响，已经开发了许多用于低温保存的技术，尽管所有这些技术都具有固有的局限性。传统的低温保存技术包括受控的冷却并且导致冰晶的形成。可选择的无冰技术，玻璃化，避免了在冷却期间形成冰晶，并且替代地包括使水凝固成无定形玻璃。

在低温保存过程中对生物样品的损伤主要发生在冷却/冷冻阶段和加温阶段期间。溶液效应、细胞外的冰形成、细胞内的冰形成、膜效应、溶质毒性和脱水全部可导致样品损伤。通过在低温保存周期期间引入具有已知的保护作用的化合物，可以减少这些效应中的一些。在低温保存期间具有保护作用的化合物被称为冷冻保护剂(cryoprotectant)或冷冻保护添加剂(cryoprotective additive)(CPA)。

存在生物样品在低温保存期间可能遇到的各种应力(stress)，这些应力及其在细胞水平上的作用的实例包括：i)温度的降低—可能潜在地引起膜脂质相的改变和/或细胞骨架的解聚；ii)溶质浓度的增加，例如溶液中溶质的浓度随着一定比例的溶剂冷冻而增加—可导致渗透收缩(osmotic shrinkage)；iii)离子浓度的增加—可以具有对膜的直接作用，包括膜蛋白的溶解；iv)脱水—可以引起脂质双层的不稳定；v)盐的沉淀和共晶体形成(eutectic formation)—可以引起细胞损伤，但机制不太清楚；vi)气泡形成—可以引起机械损伤；vii)粘度的增加—可能影响扩散过程，包括渗透；viii)pH值改变—可以引起蛋白质等的变性；以及ix)细胞变得紧密堆积—可以引起膜损伤。因此存在对于使生物样品向这些各种应力的暴露最小化的低温保存技术的需求。

在标准低温保存技术(有时被称为常规低温保存或平衡低温保存(equilibriumcryopreservation))中，细胞或生物质以特定的速率在控制速率的冷冻机或较便宜的装置例如Mr Frosty或CellCool中被冷却。当样品温度下降到低于其平衡熔点时，冰开始形成(成核)，并且然后冰晶从成核点扩展到整个样品，这常常引起不可修复的损伤。随着冰形成过程继续进行，诸如细胞的生物样品在冰之间的溶质密集的通道中聚集，直到这些通道本身凝固(通过玻璃化)，并且然后样品在其指定的储存温度被储存。

由于可能发生的直接冰损伤，这些存在冰的低温保存技术通常被认为不适合保存组织和器官。简言之，冰晶可能在细胞之间膨胀或生长到细胞内，这引起组织宏观结构的破坏，并且因此破坏组织的功能。实际上，虽然一些细胞外的冰在器官和组织中可以被承受，但细胞内的冰对细胞几乎总是致命的。迄今为止，在存在冰的体系中已经被成功地低温保存的唯一的哺乳动物器官是绵羊卵巢，并且这些器官明显比大多数器官或实际上组织工程化的构建体(tissue-engineered construct)小得多(参见Campbell等人，HumanReproduction 2014年8月；29(8)：1749–1763)。

尽管常规低温保存是对于大量应用的经证实的技术，但其应用通常被限制于细胞或小聚集体的悬浮液。对于体积大于1mm³的活检样品，例如组织、器官或多细胞有机体，由于冰损伤，在冻融期间发生对材料的不可接受的损伤。