[发明专利]基因组基因座的增强的重组

说明书

本公开提供用于通过允许重组发生并且选择在所选择的基因座内具有分子变异的事件来加速所述选择的基因组基因座处的重组的方法。加速的重组在存在于植物或哺乳动物基因组中的基因簇中产生新颖变异。

相关申请的交叉参考

本申请要求2015年8月21日提交的美国临时申请No.62/208,405的优先权，该临时申请以全文引用的方式并入本文中。

序列表的合并

本申请含有与其一起电子提交的序列表，所述序列表含有命名为“P34266WO00_SEQ.txt”的文件，所述文件大小为92,429个字符(在中测量)，创建于2016年8月18日，且以全文引用的方式并入本文中。

领域

本公开提供用于通过引入位点-特异性基因组修饰，允许重组发生并且选择在所选择的基因组基因座内具有分子变异的事件来增强预先选择的基因组基因座处的重组的组合物和方法。

背景

基因多样性为环境适应的基础。目前，植物育种者依赖于产生基因多样性的天然机制，所述天然机制依赖于罕见的随机突变或重组事件来产生具有诸如对新植物病原体生物型的抗性等所需性状的植株。然后，使用标准植物育种来将所需性状整合至所选优良种质系中，不过这是一种缓慢且成本高的方法，涉及多轮回交和选择。在一些情况下，标准育种技术不能克服与不利性状相关的某些遗传连锁(genetic linkage)。

因此，需要将有助于加速开发新的基因座来产生具有改善的环境适应和农艺学性状的植株的方法。在育种方案中还需要具有用于刺激单一细胞内的顺式染色体交换、姐妹染色体交换或多个染色体交换事件的方法。

概要

若干实施方案涉及一种产生具有新串联重复基因阵列的植株的方法，所述方法包括使植物细胞与第一位点-特异性基因组修饰酶接触，所述第一位点-特异性基因组修饰酶在第一串联重复基因阵列的至少一个靶序列中引入基因组修饰，由此诱导与第二串联重复基因阵列的重组；以及选择包含新串联重复基因阵列的至少一个植株。在一些实施方案中，产生两种新串联重复基因阵列基因座。在一些实施方案中，第一串联重复基因阵列和第二串联重复基因阵列位于同源染色体上。在一些实施方案中，第一串联重复基因阵列和第二串联重复基因阵列位于非同源染色体上。在一些实施方案中，第一串联重复基因阵列和第二串联重复基因阵列位于部分同源染色体上。在一些实施方案中，基因组修饰为双链断裂(DSB)。在一些实施方案中，基因组修饰为单链断裂。在一些实施方案中，基因组修饰为重组酶介导的DNA交换反应。在一些实施方案中，基因组修饰为转座酶介导的DNA交换反应。在一些实施方案中，在减数分裂开始时发生基因组修饰。在一些实施方案中，重组为不对称的，并且新串联重复基因阵列与第一串联重复基因阵列或第二串联重复基因阵列相比具有增加的基因数目。在一些实施方案中，重组为不对称的，并且新串联重复基因阵列与第一串联重复基因阵列或第二串联重复基因阵列相比具有减少的基因数目。在一些实施方案中，重组为对称的。在一些实施方案中，重组为对称的，第一串联重复基因阵列和第二串联重复基因阵列为异源的，并且新串联重复基因阵列包含新的基因组合。在一些实施方案中，靶序列位于第一串联重复基因阵列的基因内。在一些实施方案中，靶序列位于基因间区内。在一些实施方案中，靶序列位于基因组基因座中，所述基因组基因座与第二阵列的基因组基因座的至少约100bp、至少约150bp、至少约200bp、至少约250bp、至少约300bp、至少约350bp、至少约400bp、至少约450bp、至少约500bp、至少约600bp、至少约700bp、至少约800bp、至少约900bp或至少约1000bp为同源的。在一些实施方案中，靶序列位于第一阵列的基因组基因座，所述基因组基因座与第二阵列的基因组基因座的至少约100bp、至少约150bp、至少约200bp、至少约250bp、至少约300bp、至少约350bp、至少约400bp、至少约450bp、至少约500bp、至少约600bp、至少约700bp、至少约800bp、至少约900bp或至少约1000bp为同源的，其中第一阵列的基因组基因座和第一阵列的基因组基因座位于基因组中的对应位置。在一些实施方案中，靶序列位于第一阵列的基因组基因座中，所述基因组基因座与第二阵列的基因组基因座的至少约100bp、至少约150bp、至少约200bp、至少约250bp、至少约300bp、至少约350bp、至少约400bp、至少约450bp、至少约500bp、至少约600bp、至少约700bp、至少约800bp、至少约900bp或至少约1000bp为同源的，其中第一阵列的基因组基因座和第一阵列的基因组基因座不位于基因组中的对应位置。在一些实施方案中，第一串联重复基因阵列和第二串联重复基因阵列为同源的。在一些实施方案中，第一串联重复基因阵列和第二串联重复基因阵列为异源的。在一些实施方案中，第一串联重复基因阵列和第二串联重复基因阵列为部分同源的。在一些实施方案中，第一串联重复基因阵列和第二串联重复基因阵列为旁系同源的。在一些实施方案中，第一串联重复基因阵列和第二串联重复基因阵列为相同的。在一些实施方案中，第一串联重复基因阵列和第二串联重复基因阵列为不相同的。在一些实施方案中，第一串联重复基因阵列是定位于第一亲本基因组中，并且第二串联重复基因阵列是定位于第二亲本基因组中。在一些实施方案中，第一亲本基因组和第二亲本基因组在性别上不相容。在一些实施方案中，第一亲本基因组和第二亲本基因组为不同的物种。在一些实施方案中，第一亲本基因组为普通小麦(Triticum aestivum)(小麦)，并且第二亲本基因组是选自卵穗山羊草(Aegilops ovate)、两芒山羊草(Ae.biuncialis)、三芒山羊草(Ae.triuncialis)、粗山羊草(Ae.quarrosa)、黑麦(Secale cereal)、野生二粒小麦(Triticum dicoccoides)、二粒小麦(Triticum dicoccum)以及硬粒小麦(Triticumdurum)。在一些实施方案中，第一亲本基因组是选自卵穗山羊草、两芒山羊草、三芒山羊草、粗山羊草、黑麦、野生二粒小麦、二粒小麦以及硬粒小麦，并且第二亲本基因组为普通小麦(小麦)。在一些实施方案中，第一亲本基因组为陆地棉(Gossypium hirsutum)(棉花)，并且第二亲本基因组是选自史特啼棉(G.sturtii)、戴维逊氏棉(G.davidsonii)、亚洲棉(G.arboretum)以及雷蒙德氏棉(G.raimondii)。在一些实施方案中，第一亲本基因组是选自史特啼棉、戴维逊氏棉、亚洲棉以及雷蒙德氏棉，并且第二亲本基因组为陆地棉(棉花)。在一些实施方案中，第一亲本基因组和/或第二亲本基因组为单倍体。在一些实施方案中，第一亲本基因组和/或第二亲本基因组为二倍体。在一些实施方案中，第一串联重复基因阵列、第二串联重复基因阵列以及新串联重复基因阵列编码NBS-LRR抗病蛋白、病原体识别受体(PRR)蛋白、种子贮藏蛋白、细胞壁组分扩展蛋白、F-框蛋白、ABC转运蛋白或丝氨酸-苏氨酸/酪氨酸蛋白质激酶。在一些实施方案中，第一串联重复基因阵列、第二串联重复基因阵列以及新串联重复基因阵列编码核糖体RNA。在一些实施方案中，至少一个包含新串联重复基因阵列的子代与包含第一串联重复基因阵列的植株、包含第二串联重复基因阵列的植株或包含第一串联重复基因阵列和第二串联重复基因阵列的植株相比展现改善的抗病性。在一些实施方案中，新串联重复基因阵列赋予对一种或多种选自以下的疾病的抗性：炭疽茎腐病(Anthracnose Stalk Rot)(禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola))、镰刀菌穗腐病(Fusarium Ear Rot)(轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides))、镰刀菌茎腐病(镰刀菌属(Fusarium spp.))、赤霉穗腐病(Gibberella Ear Rot)(念珠状赤霉(Gibberellamoniliformis))、赤霉茎腐病(玉米赤霉(Gibberella zeae))、戈斯氏萎蔫病(Goss'sWilt)和叶枯病(苜蓿萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis))、灰色叶斑病(玉蜀黍尾孢菌(Cercospora zeae-maydis)、玉米尾孢菌(C.zeina))、北方玉米叶枯病(大斑凸脐蠕孢(Exserohilum turcicum))、猝死综合征(茄病镰刀菌(Fusarium solanif.sp.glycines))、亚洲大豆锈病(豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi))、疫霉根腐和茎腐病(Phytophthora root and stem rot)(大豆疫霉(Phytophthora sojae))、根结线虫病(Root-knot Nematode)(根结线虫属(Meloidogyne spp.))、大豆胞囊线虫病(SoybeanCyst Nematode)(大豆胞囊线虫(Heterodera glycines))、肾形线虫病(Reniformnematode)(肾状轮线虫(Rotylenchulus reniformis))、根结线虫病(南方根结线虫(Meloidogyne incognita))、镰刀菌萎蔫病(尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fusariumoxysporurn f.sp.vasinfectum))、轮枝孢菌萎蔫病(Verticillium wilt)(大丽轮枝孢菌(Verticillium dahlia))、镰刀菌首枯病(禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum))、镰刀菌苗枯病(镰刀菌属、颖枯壳针孢(Septoria nodorum))、镰刀菌叶斑病(雪腐小画线壳(Monographella nivalis))以及茎锈病(禾柄锈菌(Puccinia graminis))。在一些实施方案中，植株为玉米植株。在一些实施方案中，植株为大豆植株。在一些实施方案中，植株为棉花植株。在一些实施方案中，植株为小麦植株。在一些实施方案中，植株为高粱植株。在一些实施方案中，植株为芥花植株。在一些实施方案中，位点-特异性基因组修饰酶为核酸内切酶。在一些实施方案中，位点-特异性基因组修饰酶为选自以下的核酸内切酶：大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、Argonaute、RNA引导性核酸内切酶、I型CRISPR-Cas系统、II型CRISPR-Cas系统或III型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，位点-特异性基因组修饰酶为选自包含以下各项的组的CRISPR相关蛋白：Cpf1、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3以及Csf4核酸酶。在一些实施方案中，位点-特异性基因组修饰酶为重组酶。在一些实施方案中，位点-特异性基因组修饰酶为RNA引导性重组酶。在一些实施方案中，位点-特异性基因组修饰酶为包含重组酶和CRISPR相关蛋白的融合蛋白。在一些实施方案中，重组酶为与DNA识别基序连接的酪氨酸重组酶，或与DNA识别基序连接的丝氨酸重组酶。在一些实施方案中，重组酶为Cre重组酶、Flp重组酶、Tnp1重组酶、PhiC31整合酶、R4整合酶或TP-901整合酶。在一些实施方案中，位点-特异性基因组修饰酶为与DNA结合域连接的转座酶。若干实施方案涉及通过根据上述方法所产生的植株、植物细胞或植物种子。