[发明专利]在具有经改造的输入/输出的微生物宿主中人乳寡糖的产生

说明书

本发明涉及用于在经遗传修饰的细菌宿主细胞中产生寡糖的方法，以及涉及所述方法中使用的经遗传修饰的宿主细胞。所述经遗传修饰的宿主细胞包含至少一种重组的糖基转移酶和至少一种编码蛋白的核酸序列，所述蛋白使得能够输出寡糖。

背景技术

人乳被认为是婴儿发育的最佳饮食。它由脂肪、蛋白质、维生素、矿物质、微量元素和复合碳水化合物混合物组成，所述复合碳水化合物混合物包括乳糖和约150种结构不同的寡糖(人乳寡糖，HMO)。

通过化学方法或通过生物技术方法产生HMO的尝试主要引起了普遍的关注，这是由于它们对婴儿的胃肠道菌群发育的有益影响，因此提倡将它们用作营养添加剂。除了这些益生元特性，迄今为止可观察到HMO的许多其他积极的作用，这扩展了它们的应用领域。

然而，大量的科学研究需要纯的单一化合物，这几乎不可实现。对于复合的游离中性和酸性寡糖而言尤其如此，对于所述寡糖而言仍缺少有竞争力的大规模生产方法(例如，乳-N-四糖(Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Gluc)、乳-N-新四糖(Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Gluc)、乳-N-岩藻戊糖I(Fuc(α1-2)Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Gluc)、乳-N-新岩藻戊糖I(Fuc(α1-2)Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Gluc)(乳-N-唾液酰戊糖a(LST-a；Neu5Ac(α2-3)Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Gluc))。用于产生这些化合物的微生物的代谢改造代表了最有希望的方法，因为化学方法不能产生数吨规模的这些分子。

对于结构上更简单的HMO(例如2’-岩藻基乳糖、3-岩藻基乳糖或3’-唾液酰乳糖)，已经开发了数种发酵方法，这些方法主要使用经代谢改造的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株。

然而，大规模的量仅可通过以下方式来实现：增加寡糖向细菌细胞外的输出，因此(i)增加产率和(ii)允许从培养液中回收所需寡糖。解决输出问题的需求似乎随着所产生的糖的大小而增大。此外，使用目前可获得的发酵方法，在产生更复杂的寡糖时，发生不想要的寡糖前体从生产细胞的输出的问题，导致在发酵培养基中产物和前体寡糖的不想要的混合。尽管已知多种转运蛋白跨膜转移单糖或二糖，但是几乎不存在任何关于更大的寡糖(例如三糖和更大的寡糖)的转运的知识。

例如，通常使用的发酵模式生物大肠杆菌的基因组编码多于500种不同的转运蛋白(Busch and Saier,Crit Rev Biochem Mol Biol.2002；37(5):287-337)。这些膜转运蛋白的分类是非常不同的，并且亚组在易位(translocation)机制、蛋白结构或进化起源方面可不同。

典型的能量驱动的主动转运蛋白逆着底物浓度或电化学梯度进行底物移动，而底物流经通道的动力学和方向主要遵循这样的梯度。根据用于易位的能量来源，泵主要可分为初级主动转运蛋白和次级主动转运蛋白，其分别利用代谢能量如ATP或电化学电势(Davidson and Maloney,Trends Microbiol.2007Oct；15(10):448-55；Forrest et al,Biochim Biophys Acta.201 1Feb；1807(2):167-88)。尽管对于数种允许能量产生、碳水化合物输入以及蛋白质和抗菌物质流出的膜蛋白获得了深入的知识，然而迄今为止仅获得了对少数所注释的细菌转运蛋白的机理过程或天然或可能底物的信息的敏锐的深刻了解。