[发明专利]确定血液样本或抽吸样本中上皮细胞浓度的方法

说明书

本发明涉及一种确定来源于人或哺乳动物并已与抗凝剂混合的血液样本或抽吸样本中上皮细胞浓度的方法。本文中，在加入各自针对上皮细胞的特异性抗原的抗体、抗体片段或抗体模拟物后，对所述样品进行温育，直至所述抗体、抗体片段或抗体模拟物与所述细胞的结合达到降低的结合率。只有在此时，才能确定所述血液样本或抽吸样本中标记的细胞的数量以及所述细胞的原始浓度。

技术领域

本发明涉及一种确定来源于人或哺乳动物并已与抗凝剂混合的血液样本或抽吸样本中上皮细胞浓度的方法。该抽吸样本可以是骨髓抽吸物、胸腔抽吸物或腹膜抽吸物的样本。

背景技术

从US 7,615,358 B2中已获知这种(确定血液样本或抽吸样本中上皮细胞浓度的)方法。在该方法中，通过添加抗体或抗体片段对存在于体液中的上皮肿瘤细胞进行标记，所述抗体或抗体片段针对由单克隆抗体HEA 125识别的人体上皮抗原。随后，将该样本施加到载体(support)上并对其进行温育，以使所述肿瘤细胞粘附到所述载体上。关于这一点，所述载体的表面上可以涂覆有支持非特异性细胞结合的试剂，例如聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine)。所述细胞的粘附通常需要花费10到15分钟。在这之后，通过细胞形态识别粘附的上皮肿瘤细胞中的活细胞，并对其进行量化，计算所述体液中存活的上皮肿瘤细胞的浓度。这涉及到通过激光扫描细胞计术对所述粘附的上皮肿瘤细胞的形态进行分析，其中通过活肿瘤细胞上特有的表面染色对它们进行检测，并基于胞内染色(intracellular staining)消除死细胞。

WO2014/047285 A1公开了一种检测和/或治疗可能受益于紫杉烷疗法的前列腺癌患者子群的方法。该方法确定从所述患者处采集的样本中是否存在雄激素受体剪接变体。为实现该目的，可以从所述样本中捕获循环肿瘤细胞，并测试其中是否存在特定剪接变体中的一个。可以通过固定化的抗体实现(所述)捕获。(所述)测试包括使用针对所述剪接变体的抗体接触所述样本，并检测所述抗体与所述剪接变体的结合。

Pizon M等人于2013年2月在《科学公共图书馆综合卷(PLOS ONE)》第8卷、第2期、e56836、第1-6页公开了一种确定乳腺癌患者血液样本中的循环上皮肿瘤细胞上的IGF受体I和VEGF受体2的方法。该方法中，在采集后的48小时内用EDTA作为抗凝剂对所述血样进行处理。此外，所述血样中的红细胞被裂解。在4℃下，在晚上对剩余的细胞与经PE标记的针对VEGF受体2的小鼠单克隆抗体以及经FITC缀合的针对EpCAM的小鼠抗体进行温育，或是在晚上对剩余的细胞与经PE标记的针对IGF受体I的小鼠单克隆抗体以及经FITC缀合的针对EpCAM的小鼠抗体进行温育。将所得确定体积的细胞悬浮液转移至ELISA板的孔中，并使用激光扫描细胞计术对其进行测量。

Hekimian K等人于2012年在《临床和实验医学杂志(Clin.Chem.Lab.Med)》的50(4)的第701-708页公开了去掩蔽(demask)乳腺癌患者体内循环的上皮肿瘤细胞上的上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)的吐温20(20)疗法。该出版物推测EpCAM由糖蛋白或膜脂蛋白掩蔽(mask)，这意味着将阻止抗体的结合。在一实验中，分别在采集当天、在采集后的第一天和采集后的第二天，每次取1ml抗凝的外周血与20μl的20一起温育5分钟，或是不用去污剂(detergent)，取1ml抗凝的外周血温育5分钟。之后，用红细胞裂解缓冲液使其中存在的红细胞裂解。然后，用针对EpCAM的抗体检测上皮细胞。实验发现，在采集当天、在采集后第一天和采集后第二天，均能够检测到在误差范围内同样高的细胞数量。而在没有20的情况下，在采集当天未能检测到任何细胞，在(采集后)第一天可能检测到比经20处理的情况下数量稍少的细胞，并可能在(采集后)第二天检测到与经20处理的情况下数量一样多的细胞。这表明，在对血液样本与所述抗体进行温育之前对该血液样本的储存也会增加细胞上的EpCAM对所述抗体的可性(accessibility)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种确定来源于人或哺乳动物并已与抗凝剂混合的血液样本或抽吸样本中上皮肿瘤细胞浓度的替代方法。