[发明专利]硫酸乙酰肝素的PDGF-B/PDGF-BB结合变体

说明书

本发明公开了源自猪粘膜血小板衍生生长因子结合的硫酸乙酰肝素(HS6)的亲和纯化。还公开了HS6在皮肤修复和再生中的应用用于治疗伤口、烧伤、溃疡和其它皮肤损伤。

发明领域

本发明涉及结合PDGF-B或PDGF-BB的硫酸乙酰肝素，且涉及其在创伤愈合中的应用，包括皮肤修复和/或再生。

背景技术

皮肤构成人体最大的器官，作为保护屏障抵挡人身伤害，辐射和温度。皮肤由在下面的间质(真皮)层和外部上皮(表皮)层组成。

皮肤伤口愈合由各种机制调节，包括细胞-细胞相互作用，细胞外基质产生和许多细胞因子和生长因子(见Paul Martin.伤口愈合-旨在完美的皮肤再生“Wound Healing-Aiming for Perfect Skin Regeneration”.Science 276(75)1997)。伤口治疗的重要目的包括快速伤口闭合以及在功能和美观上令人满意的瘢痕。

皮肤的伤口愈合通过诸多事件的重叠模式进行，包括凝血，炎症，组织形成(上皮形成，肉芽组织形成和基质形成)和组织重塑。PDGF BB与炎症，肉芽发生，组织形成，再上皮化，基质形成和重塑过程有关。修复过程在很大程度上是通过相互作用的分子信号，主要是细胞因子介导。初始损伤引发凝血和急性局部炎症反应，随后是间充质干细胞募集，增殖和基质合成。不能解决炎症可导致慢性非愈合伤口，而不受控制的基质积累可导致过度瘢痕形成。

已知对伤口愈合至关重要的主要生长因子之一是血小板衍生生长因子(PDGF)，其是由许多类型的细胞生成的肝素结合蛋白家族，包括血小板，巨噬细胞，平滑肌和内皮细胞。PDGF-BB(PDGF-B的同型二聚体)变体是食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗非愈合性糖尿病性溃疡的唯一生长因子。然而，过度使用PDGF-BB与癌症风险增加有关。

糖胺聚糖是与多种蛋白质相互作用以调节其功能的复杂，线性，高电荷的碳水化合物；它们通常被合成附着于核心蛋白质。GAG分为非硫酸化(HA)和硫酸化(CS，DS，KS，肝素和HS)。

在GAG中，硫酸乙酰肝素(HS)家族是特别感兴趣的，因为其能够基于其结构域内的特定序列与靶向蛋白质相互作用。家族(肝素和HS)由具有可变模式的N-和O-硫酸化的重复的糖醛酸-(1→4)-D-葡糖胺二糖亚基组成。例如，肝素的抗凝血活性需要用独特的五糖排列在葡萄糖胺残留中进行3O-硫酸化(Lindahl U,Backstrom G,Hook M,Thunberg L,Fransson LA,Linker A.肝素中抗凝血酶结合位点的结构Structure of theantithrombin-binding site in heparin.Proc Natl Acad Sci U S A.1979；76:3198-202.)。独特的硫酸化模式对于ECM蛋白也是显而易见的；结合FN的易感肝素结合变体特别高度带电，需要7至8个N-硫酸化二糖，并且具有比常规更大的结构域(14个残基)(FalconeDJ，Salisbury BGJ.纤连蛋白刺激巨噬细胞摄取低密度脂蛋白-肝素-胶原复合物。Arteriosclerosis.1988；8：263-73；Mahalingam Y，Gallagher JT，Couchman JR。对纤连蛋白的肝素结合(Hepll)结构域的细胞粘附反应需要具有特定性质的硫酸乙酰肝素。J BiolChem.2007；282：3221-30)。然而，HS通过具有由未硫酸化的NA结构域分离的高度硫酸化的NS结构域而不同于这种硫酸化肝素；这种情况提供选择性结合蛋白质的独特排列，而没有肝素的副作用(Gandhi NS,Mancera RL.糖胺聚糖的结构及其与蛋白质的相互作用TheStructure of Glycosaminoglycans and their Interactions with Proteins.ChemBiol Drug Des.2008；72：455-82)。