[发明专利]改进的光动力学方法及由其获得的产物

说明书

发明领域

本发明涉及光动力学方法及由其获得的产物。尤其地，本发明涉及用于耗尽来自细胞群的某些细胞的光动力学方法及由其获得的产物。

发明背景

移植或同种异体移植涉及从一个个体或多个个体(供体)向另一个体(受体)捐赠材料。在同种异体移植期间，供体细胞可与受体细胞和组织发生反应(移植物抗宿主病)，这是由于HLA抗原中的错配引起的不必要的反应。有若干种方法来鉴定和消除与受体细胞反应并被受体细胞激活的供体细胞，通常是T淋巴细胞。混合淋巴细胞反应是离体方法，其可用于研究宿主和供体细胞之间的反应性。结合光动力学治疗，它可用于选择性消除被宿主细胞激活的供体细胞。

这种同种异体反应性T细胞的组合鉴定和消除用于制造选择性耗尽针对宿主的同种异体反应性T细胞的富含T细胞的供体淋巴细胞制剂。这是例如在WO 01/24824中所描述的，其中这些制剂是通过在IL-2存在下将供体细胞与γ辐照的受体细胞混合来制备的，以在受体的错配的主要HLA抗原的方向上诱导供体细胞的单向MLR。培养期后，收获细胞并暴露于积聚在所有细胞中的荧光光敏罗丹明化合物TH9402。在不存在TH9402的培养基中孵育细胞的后续期之后，优选将染料保留在以单向MLR激活的那些细胞中，即那些与受体的错配的HLA抗原反应的供体细胞。接下来，将细胞暴露于可见波长的光，导致TH9402的活化和高细胞毒性活性氧自由基的产生，从而消除那些与受体的错配的HLA-抗原反应的供体细胞，但避开其它供体细胞。Mielke等(2008)Blood 111:4392-4402描述了一种MLR，其中使用抗CD3和IL-2产生的扩增T细胞与来自HLA匹配或错配的供体的应答细胞共培养。在该研究中，用7.5微摩尔TH9402的孵育比用5微摩尔的孵育得到显著更好的结果。Perrucio等(2007)Blood Cells Molecules and Diseases 40:76-83描述了一种MLR方法，随后进行光动力学处理，无需挤出步骤。细胞群死亡百分之九十至百分之九十五。

该方法的主要限制是在单次处理中可以处理的细胞数量。待处理细胞的浓度在挤出相中不能超过一百万个细胞/ml，而不损害最终产物的质量。因此，为了处理更多的细胞，需要增加在该方法中待处理的体积。然而，操纵大体积，例如一升甚至更大，是困难的，并影响处理的稳定性和可重复性。对一名患者的足够的细胞进行光动力学处理将需要约十个照射装置或若干轮处理。

发明详述

本发明涉及光动力学方法，其包括：

(i)将细胞制剂在包含5微摩尔或更少的光敏化合物的培养基中孵育；

(ii)用挤出培养基(extrusion medium)代替(i)中的培养基以除去光敏化合物，和

(iii)照射挤出培养基中的细胞制剂以选择性地杀伤已经保留光敏化合物的那些细胞。

根据本发明的方法的一个优点是相对于在使用多于5微摩尔、例如10微摩尔的光敏化合物的参考方法中所常规使用的，在挤出相中可使用更小的体积和更高的细胞浓度，而不损害最终产物的质量。令人惊奇的是，与通过使用多于5微摩尔光敏化合物、例如10微摩尔光敏化合物的参考方法可获得或获得的参考细胞产物相比，通过该方法可获得的细胞产物得到改善。另一个优点是可以在相同时间和相同条件下光动力学处理更多的细胞。另一个优点是可使用较少的光敏化合物，同时获得与参考细胞产物相比改善的细胞产物。所有这些优点对标准化和效率和处理的容易性都有很大的影响。现有技术方法仅允许低浓度、例如1×10⁶细胞/ml的光动力学处理。如果使用每个实验能够处理例如100×10⁶个细胞的照射装置，总共处理1×10⁹个细胞，其为一个人的平均细胞数量，将需要10轮100×10⁶个细胞或同时使用10个照射装置。各轮处理之间的处理条件可能略有差异，因此优选避免若干轮处理。对于一次处理使用十个照射装置也是昂贵的并且占用空间，因此也优选避免。使用根据本发明的方法，可以以更高的浓度和更小的体积来处理1x10⁹个细胞。因此，照射装置的数量可以减少80％至一个或两个，并且所有的细胞可以在相同时间和相同条件下进行处理。根据本发明的方法导致挤出相中的细胞浓度高于染色相中的细胞浓度。这允许重要的培养基减少，促进可扩展性(scalability)，并允许用相等的设备处理更多的细胞。