[发明专利]一种人体血清叶酸及其代谢物串联质谱检测试剂盒

权利要求书

1.一种人体血清叶酸及其代谢物串联质谱检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括校准品、质控品、内标准液、解离剂、解离剂稀释液、流动相A液、流动相B液、复溶液、96孔微孔板、操作说明书及其分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，适用于高效液相色谱-串联质谱仪。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于试剂盒各组成成分及其配制方法分别如下所述：

1)校准品：使用2％～8％BSA稀释液，同时加入一定量的叶酸、5-甲基四氢叶酸和5-甲酰四氢叶酸原料，配制成6个浓度剂量点的校准品，即0ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、1.8ng/mL、5.4ng/mL、27.0ng/mL的6个浓度剂量点校准品A～F，冻干后使用；

2)质控品：使用2％～8％BSA稀释液，同时加入一定量的叶酸、5-甲基四氢叶酸和5-甲酰四氢叶酸原料，配制成2个浓度的质控品，即2.0ng/mL和10.0ng/mL的C1和质控品C2，冻干后使用；

3)内标准品：使用2％～8％BSA稀释液作为稀释液，同时将¹³C5叶酸和d3 5-甲基四氢叶酸稀释至终浓度为300ng/mL～600ng/mL，冻干后使用；

4)解离剂：1M DTT水溶液；

5)解离剂稀释液：0.1M PBS缓冲液；

6)流动相A：由甲酸与纯化水配制而成，甲酸的含量为0.05％～0.2％；

7)流动相B：由甲酸与乙腈配制而成，甲酸的含量为0.05％～0.2％；

8)复溶液：由乙腈与纯化水配制而成，乙腈的含量为0.5％～2％；

9)96孔微孔板：由无包被的96孔深孔微孔板作为反应板和无包被的96孔微孔板作为进样板组成，且使用耐腐蚀的聚丙乙烯材料制成。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征还在于：

1)所述2％～8％BSA由含量均为0.01％的DTT、抗坏血酸和柠檬酸-水合物组成，且校准品和质控品中，优选4％浓度的BSA；

2)所述内标准品中优选2％浓度的BSA稀释液，且优选¹³C5叶酸和d3 5-甲基四氢叶酸的浓度为400mg/mL；

3)所述流动相A和流动相B中甲酸的含量优选0.1％；

4)所述复溶液中乙腈的含量优选1％；

5)所述96孔微孔板中的反应板优选U型底，进样板优选V型底。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于该试剂盒的使用包括以下步骤：

1)、准备工作液：通过以一定的比例稀释试剂盒中的校准品、质控品、内标准品、解离剂和解离稀释液，以满足样品处理所需；

2)样品前处理：取200μL的血清样品与一定量的解离工作液于96孔深孔微孔板中混合，37℃温育5min；加入一定量的内标准品工作液，离心分离上清后氮气室温彻底吹干，加入一定量的复溶液至溶解完全；

3)移液：从步骤2)中每个板孔中将50μL/孔溶液转移到96孔微孔板进样板孔内；

4)设置色谱和质谱条件：根据实际仪器型号分别设置高效液相色谱和串联质谱仪的工作参数和条件；

6)样品检测：将处理好的校准品、质控品和血清样品各20μL注入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测分析，并记录色谱图与检测样品中叶酸、5-甲基四氢叶酸和5-甲酰四氢叶酸的峰面积与内标峰面积；

7)结果分析：绘制标准曲线和计算曲线回归方程，计算出样品中叶酸、5-甲基四氢叶酸和5-甲酰四氢叶酸的浓度。

5.根据权利要求4所述的试剂盒使用步骤，其特征还在于：

1)所述步骤1)中具体的：将冻干的校准品和质控品用纯化水溶解成工作液；按照解离剂∶解离剂稀释液＝1∶4的比例配制成解离工作液，按照按内标准品∶乙腈＝1∶199配制成内标准品工作液；

2)所述步骤5)中的设备条件设置如下：

①色谱条件：优选Poroshell120EC-C18(4.6*50mm)色谱柱，0.6mL/min流速，40℃柱温；

②质谱条件：优选ESI正离子MRM扫描模式，Q1/Q3离子通道分别选择为叶酸：442.2→295.2amu，¹³C5叶酸：447.2→295.2amu；5-甲基四氢叶酸：460.3→313.3amu；¹³C5-甲基四氢叶酸，d3：464.3→317.3amu和5-甲酰四氢叶酸：474.3→327.3amu。