[发明专利]一种聚肽的快速检测方法

说明书

本发明涉及生化分析领域，具体公开了一种聚肽的快速检测方法，本发明将离子交换柱应用于HPLC仪器平台，取微量样品就能快速检测供试品中的聚肽，包括步骤：取发酵或纯化过程中的样品配制供试品溶液，色谱柱以阴离子交换树脂为填料，以磷酸盐缓冲液或Tris‑HCl缓冲液为洗脱液A，以NaCl溶液或KCl溶液为洗脱液B，梯度洗脱，使聚肽可以和杂蛋白、核酸等杂质很好地分离。本发明的检测方法具有较好的线性范围、重复性和加样回收率，较低的检测限，操作简单，灵敏度高，能快速检测供试样品中的聚肽。

技术领域

本发明涉及生化分析检测领域，具体涉及一种聚肽的快速检测方法。

背景技术

聚阴离子聚肽的盐溶液(如钠盐、钾盐等)极性强、水溶性好，用传统的C₁₈色谱填料分离分析保留时间短，很难将其与杂蛋白或核酸等杂质分开。电泳检测只能定性，不能定量。高效快速地检测发酵和纯化过程中聚肽含量不仅能提高筛选聚肽高产菌株和纯化的效率，并且对发酵和纯化条件的优化、工艺控制及质量标准的建立有着非常重要的意义。

目前常用于测定发酵或纯化过程中聚肽含量的方法通常为水解法，将聚肽水解为对应的单个氨基酸，测定水解前后对应氨基酸含量之差，水解前后样品中氨基酸的含量可通过生物传感分析仪如L-谷氨酸氧化酶电极或HPLC等方法测定(施庆珊，等：一株不需谷氨酸的产聚γ-谷氨酸菌株的筛选与鉴定；孟杰，等：酶法快速检测发酵液中的γ-聚谷氨酸浓度)，也有用凝胶色谱测定γ-PGA含量的(Yao J，et al.Removal of Cr(III)，Ni(II)andCu(II)by poly(γ-glutamic acid)from Bacillus subtilis NX-2[J].)。张庆庆等在《发酵液中γ-聚谷氨酸含量快速测定方法研究》中用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液与γ-PGA反应产生浑浊的特性，通过反应体系的吸光度来反映其浊度，进而通过浊度与γ-PGA浓度的线性关系，测定发酵液中γ-PGA。

现有技术中的水解法过程繁琐、水解程度对结果准确性影响较大；凝胶色谱法是根据分子量大小不同保留时间不同来检测的，由于大分子相近分子量的物质较多，凝胶色谱本身的分辨率有限，所以也存在较大的误差；而CTAB法中的CTAB很容易与杂蛋白反应产生浑浊，进而影响检测的准确性。因此，很有必要建立一种聚肽快速、准确的检测方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术上的不足，提供了一种聚肽的快速检测方法。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种聚肽的快速检测方法，包括如下步骤：

(1)样品溶液的配制：取发酵液或发酵菌体破碎液或纯化中间过程溶液适量，过0.22μm滤膜；

(2)样品的测定：采用高效液相离子交换色谱法，以10-30mM的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲溶液或K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液作为洗脱液A，调pH至7.5-8.5，以洗脱液A为溶剂配制1-3M的NaCl溶液或KCl盐溶液为洗脱液B；

所述离子交换色谱条件为：填料Q Sepharose^TM FF装填于空管柱或使用预装柱；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.1-2mL/min；洗脱方式：0-10min，100％A等度洗脱；10-25min，洗脱液A:洗脱液B为(85-95):(15-5)；25-45min，洗脱液A:洗脱液B为(75-85):(25-15)；45-60min，洗脱液A:洗脱液B为(60-75):(25-40)；60-80min，100％B等度洗脱，之后通过双波长紫外检测器检测；

(3)含量分析。