[发明专利]一种毒素Tx4(6-1)无标签重组蛋白的生产方法

说明书

本发明涉及一种毒素Tx4(6‑1)无标签重组蛋白的生产方法，本发明提供的基因，是如下由序列表中序列1所示的DNA分子；（1）利用序列表1的基因序列，可以实现该毒素基因在大肠杆菌中的可溶性高水平融合表达；（2）融合表达的可溶性蛋白经切割和去除非目标蛋白，得到了与天然成熟Tx4(6‑1)蛋白在氨基酸序列上完全相同的重组蛋白；（3）得到的与天然成熟Tx4(6‑1)蛋白在氨基酸序列上完全相同的重组蛋白具有很强的生物活性。本发明优化了Tx4(6‑1)的DNA序列，筛选了表达菌株、表达载体且提供了一种高效生产活性Tx4(6‑1)重组蛋白的方法，有利于对该毒素蛋白的抗虫特性和生物安全性开展详细研究，并对相应抗虫植株、高毒力转基因生物杀虫剂的筛选具有重要的意义。

技术领域

本发明涉及利用生物技术领域，具体涉及一种蜘蜘神经毒素Tx4(6-1)的优化编码基因与重组蛋白的生产。

背景技术

昆虫神经毒素是一类只作用于昆虫神经系统，有毒杀作用的多肽类神经毒素，主要来自于蝎，其次来自蜘蛛。这类对昆虫有专一毒杀作用的毒素的作用位点是各种离子通道，具有高效昆虫专一性的神经毒素主要是作用于钠离子通道的长链神经毒素，这类长链神经毒素一般由60-70个氨基酸组成，有2-4对链内二硫键。不同种属来源的神经毒素在氨基酸的组成上没有明显的保守性，而同种来源神经毒素在一级结构上具有很高的保守性。蜘蛛神经毒素基因TX4 (6-1)是一种源自巴西流浪蜘蛛”(Phoneutria nigriventer)的昆虫专一性神经毒素，对农业害虫具有很可的毒杀活性。昆虫神经毒素具有控制农业害虫的重要潜在价值，但天然昆虫神经毒素在毒腺中的含量低且提取困难的，并且往往只能得到非常少量的纯品，这就给我们进一步研究这些毒素的特性带来了很大的困难。因此，通过分离少量昆虫毒素，测定其氨基酸组成，再得到其成熟基因全长，通过体外大量表达，成为研究这些毒素的一条重要途径。

现有技术中将昆虫神经毒素构建表达载体，然后转化到E. coli BL21(DE3)进行表达，但得到的都是无活性的包涵体，通过在体外合适的条件下进行溶解、变性、复性和纯化，从每升培养基仅能得到微量的可溶性蛋白质，生产量低；也存在将构建的表达载体在酵母中表达的方法，但其表达量低且分离纯化困难。目前，还没有通过改造Tx4(6-1)的DNA序列且优化Tx4(6-1)表达纯化方法来高效生产Tx4(6-1)重组蛋白的方式，极大影响了Tx4(6-1)的抗虫特性和生物安全性的分析研究尤其影响其在抗虫中的应用，因此需开发出一种可以降低成本、实现大量生产且具有生物活性的昆虫神经毒素Tx4(6-1)的方法。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的之一在于提供一种蜘蜘神经毒素Tx4(6-1)的编码基因及其重组蛋白的生产方法。

本发明提供基因，为编码蜘蜘神经毒素Tx4(6-1)类蛋白的基因，为序列表中序列1所示的DNA分子，其编码基因的读码框包含147个核苷酸，其中前144个核苷酸编码对应的氨基酸，后3个核苷酸为终止密码子。序列表中的序列1翻译成的蛋白包括48个氨基酸残基，为序列表中序列2所示的蛋白质分子。

所述重组载体具体为将上述基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。所述重组载体具体优选为将上述基因插入表达载体pET32的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。上述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4，利用序列3和序列4的引物扩增的目标基因同样可以进行相关的酶切和连接操作。

本发明的第二个目的是提供一种制备蛋白的方法，包括步骤：将含有权利要求1所述的基因的重组表达载体导入宿主细胞，所述宿主细胞优选为大肠杆菌，用于构建所述重组表达载体的原始载体优选为pET32载体。