[发明专利]一种重组蝎神经毒素LqhIT2蛋白的制备方法

说明书

本发明公开了一种高效制备重组活性蝎昆虫神毒素LqhIT2的方法，主要包括以下步骤：（1）根据LqhIT2成熟毒素的氨基酸序列和毕赤酵母表达系统的特点优化并合成C‑端带有6×His标签的LqhIT2的基因并构建毕赤酵母分泌表达载体；（2）转化重组载体到毕赤酵母宿主中，通过筛选，得到了高水平分泌表达的酵母转化子；（3）酵母宿主中表达重组蝎昆虫神毒素LqhIT2蛋白，经镍亲合层析法，快速得到了纯度达98%以上的重组蝎昆虫神毒素LqhIT2蛋白，纯化的重组蛋白对昆虫细胞具有很强的毒杀活性。本发明改变了传统的用原核宿主大肠杆菌表达昆虫神毒素LqhIT2，探索出用真核宿主毕赤酵母来表达昆虫神毒素LqhIT2的方法，并筛选到了高水平分泌表达的酵母转化子。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种蝎神经毒素LqhIT2优化基因及其重组蛋白的制备方法与应用。

背景技术

昆虫神经毒素是一类只作用于昆虫神经系统，有毒杀作用的多肽类神经毒素，主要来自蝎子、蜘蛛、螨虫、胡蜂、蚂蚁等动物毒腺分泌的毒液。到目前为止，已分离纯化和命名的昆虫神经毒素有近百种，主要来自于蜘蛛子，其次来自蜘蛛。蝎昆虫神经毒素LqhIT2是一种从以色列黄蝎Leiurus quinquestriatus hebraeus (Ehrenberg)的毒液中分离得到的昆虫长链神经毒素，成熟毒素由61个氨基酸组成，含有4对链内二硫键，其作用位点是昆虫的钠离子通道，该毒素具有较强的抗昆虫活性。昆虫神经毒素具有控制农业害虫的重要潜在价值，但天然昆虫神经毒素在毒腺中的含量低且提取困难的，并且往往只能得到非常少量的纯品，这就给我们进一步研究这些毒素的特性带来了很大的困难。因此，通过分离少量昆虫毒素，测定其氨基酸组成，再得到其成熟基因全长，通过体外大量表达，成为研究这些毒素的一条重要途径。目前，人们已经开发了很多表达系统如：杆状病毒表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、丝状真菌表达系统、昆虫细胞表达系统、植物表达系统、哺乳动物表达系统等，为大量制备该类神经毒素提供了有效手段。

甲醇酵母表达系统是应用最广泛的酵母表达系统，以Pichia pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还具其它很多显著优点，如易操作、高密度发酵放大容易、成本低且可以高水平分泌。目前，还没有利用毕赤酵母表达系统高效表达并纯化活性LqhIT2重组蛋白的相关报告，极大影响了LqhIT2活性测定、杀虫谱分析及其在抗农业害虫中的应用，因此开发出一种利用毕赤酵母高水平分泌表达大量LqhIT2蛋白并快速、低成本的制备具有生物活性的昆虫神毒素LqhIT2蛋白是十分必要的。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的之一在于提供一种蝎神经毒素LqhIT2优化重组基因。本发明提供基因，为编码蝎神经毒素LqhIT2蛋白的基因，为序列表中序列1所示的DNA分子。其中，序列表中的序列1由204个脱氧核苷酸组成，该序列为包含6个组氨酸标签(18个脱氧核苷酸)的LqhIT2基因读码框(183个脱氧核苷酸)和终止密码子(3个脱氧核苷酸)，编码具有序列表中序列2的由67个氨基酸残基序列组成的蛋白质。

由上述序列表中的序列1编码得到的蛋白属于本发明的保护范围。含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组载体具体为将上述基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。所述重组载体具体优选为将上述基因插入表达载体pPICZαA的XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。上述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4，利用序列3和序列4的引物扩增的目标基因同样可以进行相关的酶切和连接操作。

本发明的第二个目的是提供一种制备重组LqhIT2蛋白的方法及应用，包括以下步骤：