[发明专利]一种基于GST‑PullDown以及质谱分析技术寻找如皋黄鸡基因互作蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学工程等相关领域。

技术背景

GST Pull-Down试验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术，近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种诱饵蛋白，将目的蛋白溶液过柱，从中捕获与之相互作用的目的蛋白，蛋白间的相互作用可以通过SDS-PAGE电泳以及其它相关的检测方法来证实，这些方法包括考马斯亮蓝、银或锌染色、Western-blotting以及放射性同位素32S检测等。李荣等人首先通过互换载体在酵母中证实与KyTo和RBP-J的相互作用。进而在大肠杆菌中表达纯化了KyoT2蛋白,并以此为抗原制备了KyoT2多克隆杭体,通过GST-pull down试验进一步在体外大肠杆菌中验证了KyoT2和互作蛋白间的相互作用。鲁凌云等人利用GST pull-down证明了ETAR C末端与FLJ在体外相互作用并探讨了ETAR和ETBR与未知蛋白分子的相互作用，从而阐明其对下游信号调节的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于GST-Pull Down以及质谱分析技术寻找如皋黄鸡基因互作蛋白的方法，采用本方法能够通过分子生物学方法快速寻找如皋黄鸡目的基因的互作蛋白，该方法目前在鸡上目前尚没有应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种基于GST-Pull Down以及质谱分析技术寻找如皋黄鸡基因互作蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)目的基因克隆以及原核表达载体构建

根据如皋黄鸡目的基因的NCBI基因登陆号寻找目的基因的CDS全序列，设计特异性引物并引入EcoR I和Hind III酶切位点，酶切位点根据目的基因的基本信息进行确定，通过PCR方法克隆目的基因CDS全序列，克隆产物纯化后经测序验证，用于后续试验；

(2)Pet-49(b)-GST-目的基因的原核融合表达载体构建

将步骤(1)测序正确的克隆产物和Pet-49(b)原核表达载体分别通过EcoR I和Hind III进行双酶切，酶切3h后进行纯化并连接，连接16h后转化DH5α，挑取阳性细菌克隆并提取质粒，通过双酶切和测序对构建的原核融合表达重组质粒进行鉴定，获取构建成功的Pet-49(b)-GST-目的基因质粒；

(3)Pet-49(b)-GST-目的基因进行原核表达

将步骤(2)获取构建成功的Pet-49(b)-GST-目的基因质粒转化原核达菌种BL，同时利用异丙基硫代半乳糖苷IPTG对BL菌种进行诱导，诱导3h后提取菌液蛋白，通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况，同时利用GST和目的基因基因抗体检测目的蛋白的表达情况；

(4)对蛋白进行大量表达和破菌检测；

(5)明确蛋白的表达位置后对表达的蛋白进行纯化和浓缩并进行GST-Pull Down试验；

(6)GST-Pull Down后的蛋白进行蛋白质还原烷基化和胶内酶解并通过LC-MS/MS鉴定获取目的基因的互作蛋白的序列。

优选的，所述步骤(4)蛋白大量表达及破菌检测具体过程为：

以300ml为例，取3mLLB液体培养基，加入抗生素；取菌液蛋白室温解冻，充分混匀后，取3μL接种入所述LB培养基中；置于摇床37℃，200rpm，过夜摇菌；将3mL过夜生长的菌液全部接种于300mL含抗生素的LB培养基，37℃，200rpm生长，降温到所需求的诱导温度后加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG进行诱导；4小时后将菌液倒入50mL离心管中，4℃8000rpm离心3min，弃上清；菌体加25mL缓冲液重悬，装入25mL烧杯内；加溶菌酶混匀，V_溶菌酶：V_菌液＝1:200；冰上30min；冰上超声，工作时间：3h；间隙时间：4s；工作次数：99；功率不超过200w；倒入离心管内，4℃16000rpm离心30min；取样品进行SDS-PAGE检测；剩余上清及沉淀至于0-7℃备用。

优选的，所述步骤(5)对表达的蛋白进行纯化和浓缩上清蛋白纯化具体过程为：

将GST琼脂糖凝胶装入层析柱，用10倍柱床体积的Buffer冲洗；将步骤(4)检测的上清样品加到层析柱中，流速控制在0.5mL/min；层析用10倍柱床体积的Buffer冲洗除杂，流速控制在1mL/min；用10倍柱床体积的GSH缓冲洗脱，流速控制在1mL/min，收集洗脱峰；SDS-PAGE跑胶检测各组分；进行蛋白浓缩。