[发明专利]一种参与丹参酮合成的2‑酮戊二酸依赖性双加氧酶基因克隆鉴定及应用

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物学及基因工程领域，特别涉及一种参与丹参酮合成的2-酮戊二酸依赖性双加氧酶基因克隆鉴定及应用。

背景技术

中药丹参是鼠尾草属唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根和根茎，是最常用的大宗药材之一，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈等功效，在临床治疗心脑血管疾病有较高使用价值。丹参生态适应性较强，在华东、华北、西北、西南、中南等地区广泛分布，现如今丹参野生资源大幅减少，主要来源于人工栽培品，于河北、江苏、安徽、辽宁、陕西、山东、河南、山西、湖北、四川等地大量种植。丹参主要活性成分是脂溶性丹参酮类化合物和水溶性酚酸类化合物。丹参基原植物具有生命力强、世代周期短、基因组小、染色体数目少、组织培养和转基因技术成熟等特点，被认为是中药研究的理想模式生物。近来，丹参主要活性成分丹参酮的生源途径正被逐步解析。由于丹参酮的高氧化活性，其生物合成途径由一系列氧化酶参与，已报道多个CYP450s参与丹参酮的合成。2OGD超家族是植物基因组中的第二大基因家族，其功能主要涉及氧化和羟基化作用，如赤霉素、黄酮类等的合成，但是目前2OGDs是否参与丹参酮的生物合成仍然未知。

发明内容

本发明目的在于探索2OGD家族成员在丹参酮合成中的功能，提供一种参与丹参酮生物合成的2OGD编码基因及应用。

本发明目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于丹参全基因组及不同丹参组织器官转录组差异表达分析的丹参酮合成途径相关2OGD超家族基因成员2OGD-5的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述基因2OGD编码蛋白质的氨基酸残基序列如SEQ ID No.2。

一种含有2OGD-5编码基因的正向和反向片段序列植物RNAi双元表达载体。

本发明通过发根农杆菌侵染丹参叶片，获得阳性2OGD-5-RNAi毛状根，毛状根经0.1mg/L IAA诱导大量侧根生成。

本发明采用代谢组(LC-MS)技术鉴定2OGD-5-RNAi转基因毛状根的隐丹参酮和丹参酮IIA的含量与对照相比显著降低。本发明提供的2OGD-5催化隐丹参酮和丹参酮IIA的生物合成，为丹参酮生物合成途径的解析奠定基础。

附图说明

图1所示为丹参基因组2OGD家族成员系统发育进化树。

图2所示为丹参2OGD家族成员编码基因在丹参不同组织器官中的差异表达。

图3所示为2OGD-5在丹参不同组织器官中的差异表达。

图4所示为丹参2OGD-5编码基因结构与及蛋白三维结构预测。

图5所示为发根农杆菌ACCC10060介导的遗传转化获得2OGD-5-RNAi的丹参毛状根。

图6所示为pK7GWIWG2D(II)-2OGD-5转基因毛状根的抑制作用图。

图7所示为UPLC分析不同转基因毛状根之间丹参酮含量差异。

图8所示为LC-MS分析不同转基因毛状根之间丹参酮含量差异。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1全基因组筛选丹参2OGD家族

1)基于丹参全基因组扫描2OG-FeII_Oxy结构域(PF03171)，筛选到丹参2OGD超家族成员132个，氨基酸序列长度分布从120aa到504aa。

2)采用MEGA比对及构建系统发育树，丹参2OGD超家族被分为DOXB和DOXC两个亚家族，其中DOXB包含14个2OGD成员，DOXC包含116个2OGD成员，如图1所示。

3)收集丹参不同器官组织及处理的转录组测序数据，采用Tophat和Cufflinks软件分析丹参2OGD成员在丹参不同器官组织及MeJA处理下的差异表达谱，如图2所示。

4)根据丹参酮在丹参不同部位的合成及积累，筛选基因差异表达一致的丹参2OGD家族成员，其中2OGD-5在丹参根中特异表达且显著受MeJA诱导，如图3所示。

实施例2丹参2OGD-5编码基因的克隆及结构分析