[发明专利]一种基于细胞层面进行全蛋白质组学分析的方法

说明书

本发明属蛋白质分析领域，涉及基于细胞层面的全蛋白质组学分析的方法，本发明中，收集的细胞直接通过吸胀的方式进入真空干燥后的聚丙烯酰胺凝胶粒中，然后直接进行胶内酶解获得质谱分析所需的肽段；本方法中不需要单独的细胞裂解和蛋白提取步骤，使四个基本步骤减少为两步，在不提高酶量的情况下，实验耗时明显缩短；本方法与传统方法比较，在细胞蛋白质组鉴定，尤其是高分子量蛋白的鉴定上存在明显优势；本发明方法步骤简单、操作方便、快速高效，可以实现同时进行细胞裂解和蛋白酶解，为高灵敏质谱分析提供样品保证；由于摆脱了对去垢剂的依赖，适用于后续诸多翻译后修饰的研究。

技术领域

本发明属蛋白质分析领域，涉及细胞全蛋白质组分析的方法，具体涉及一种基于细胞层面进行全蛋白质组学分析的方法，本方法还涉及直接在细胞层面进行酶解用于后续质谱分析的蛋白质组学样品的制备方法。

背景技术

现有技术公开了细胞是生物体结构和功能的基本单元，包括肿瘤在内的若干疾病均与细胞的功能失调相关，因此，永生细胞系被广泛用于人类疾病的生物学研究，包括与疾病有关的蛋白质组学研究。近年来，基于生物质谱的蛋白质组学技术发展迅猛，然而，作为该项技术的关键上游环节，目前的涉及的样品制备技术尚有需要改进的地方，传统的蛋白质组学样品制备流程通常包括以下步骤： 1）细胞的收集与裂解；2）蛋白的提取和纯化；3）蛋白质酶解；4）肽段除盐；实践显示，该经典的样品制备流程过于冗长，极大地制约了质谱技术的推广，为了克服所述缺陷，有研究提出新的同步碎裂-酶解方案，其中，依靠较高的酶-底物比，较成功实现了快速的磷酸化蛋白质样品制备，但该方法只能用于磷酸化蛋白质组学的研究，若是用于细胞全蛋白质组学研究，则需要额外的步骤用于去除去垢剂以及其它的细胞内生物大分子。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种步骤简单、操作方便、快速高效、不依赖去垢剂的细胞全蛋白质组学分析新方法。具体涉及一种直接在细胞层面进行蛋白酶解的细胞全蛋白质组学分析方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种步骤简单、操作方便、快速高效、不依赖去垢剂的细胞全蛋白质组学分析新方法。具体涉及一种基于细胞层面进行全蛋白质组学分析的方法，本方法中尤其涉及直接在细胞层面进行酶解用于后续质谱分析的蛋白质组学样品的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1.制备聚丙烯酰胺凝胶；

2.收集与清洗细胞样品；

3.细胞蛋白的酶解处理；

4.酶解后的肽段洗脱后送入质谱分析。

本发明中将收集的细胞直接通过吸胀的方式进入真空干燥后的聚丙烯酰胺凝胶粒中，然后直接进行胶内酶解获得质谱分析所需的肽段，因此，不需要单独的细胞裂解和蛋白提取步骤，使四个基本步骤减少为两步，在不提高酶量的情况下，实验耗时明显缩短。

具体的，本发明借助聚丙烯酰胺凝胶实现了直接在细胞层面进行细胞全蛋白质组的酶解和后续质谱分析；当细胞溶液被加入到含真空干燥的凝胶颗粒的离心管中，溶液中的细胞通过吸胀的方式进入凝胶颗粒中，嵌入在凝胶颗粒中的细胞蛋白直接被胰酶酶解成肽段，而后送入质谱进行检测；由于所有细胞蛋白均随着吸胀过程中进入凝胶颗粒中，一些较难溶的蛋白在胰酶的作用下，部分裂解后变成易溶的肽段，因此通过本方法进行酶解，无须额外加入助溶剂。

更具体的，本发明的基于细胞层面进行全蛋白质组学分析的方法，其特征在于，其包括步骤：

（1）制备聚丙烯酰胺凝胶；

（2）收集细胞样品，用PBS缓冲液洗2次；

（3）将细胞溶液与真空干燥的凝胶颗粒混合，冰浴静置；

（4）对样品进行冷热交替处理2次后，用50%乙腈和100%乙腈各洗2次；