[发明专利]一种凝血酶的检测方法

说明书

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种凝血酶的检测方法及检测凝血酶的组合物。本发明所述组合物包括标记有核酸适配子的银纳米三角片和标记有核酸适配子的上转换纳米粒子；所述银纳米三角片上标记的核酸适配子和上转换纳米粒子上标记的核酸适配子为与凝血酶特异性结合的核苷酸序列。本发明所述检测方法将标记有核酸适配子的银纳米三角片溶液与标记有核酸适配子的上转换纳米粒子溶液混合均匀，得检测体系；在所述检测体系中加入待检测样品，进行拉曼光谱检测。本发明所述检测方法具有检测灵敏度高，成本低，背景荧光干扰小，方法简单，便于操作等优点。

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种凝血酶的检测方法及检测凝血酶的组合物。

背景技术

凝血酶是一种由凝血酶前体形成的丝氨酸蛋白质水解酶，具有催化纤维蛋白原变成纤维蛋白、促进血液凝固和调控凝血等作用，在揭示肿瘤的发生机制及作为早期诊断、疗效及愈后判断依据等方面有着非常重大的意义。由于血液中凝血酶的浓度达10nmol/L，建立简单、快速、高灵敏度检测凝血酶的方法具有非常重要的意义。

目前国内外凝血酶的检测方法包括电化学方法、荧光检测方法、局域表面等离子体共振(LSPR)探测等。其中电化学方面通常较复杂，检测灵敏度在百纳摩尔水平已是极限。荧光检测通常在可见光范围激发，容易激发生物体内有机分子，产生强背景干扰，无法进行在体检测。而LSPR检测相对较简便，例如基于贵金属金银纳米粒子的LSPR探测可以实现裸眼检测，但裸眼检测仅在大浓度范围有效，灵敏度仍在1.6nM以上水平。

上转换纳米粒子发光检测具有高灵敏度、无光漂白、低荧光背景等特性，在生物/化学检测领域有重要应用。例如韩国Kim教授利用上转换纳米粒子实现对血红蛋白的检测(Anal.Chem.2016,88,2742-2746)。而利用上转换纳米粒子检测凝血酶的方法通常采用有机分子、碳纳米点、金纳米粒子等作为发光受主实现检测。然而凝血酶在血液内，浓度仅有纳摩尔水平，以上述材料作为受主，由于其消光系数低，导致检测灵敏度低(仅到达纳摩尔水平)。并且，血液具有极强的背景荧光干扰，产生荧光背景信号进一步降低检测灵敏度。

因此，研发一种检测灵敏度高、荧光背景低的凝血酶检测方法，成为人们亟待解决的问题。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提供一种凝血酶的检测方法，以解决现有凝血酶检测方法存在的灵敏度低、背景荧光高等问题。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测凝血酶的组合物，包括标记有核酸适配子的银纳米三角片和标记有核酸适配子的上转换纳米粒子；所述银纳米三角片上标记的核酸适配子和上转换纳米粒子上标记的核酸适配子为与凝血酶特异性结合的核苷酸序列。

优选的，所述银纳米三角片上标记的核酸适配子为5’端带有巯基的与凝血酶特异性结合的核苷酸序列；所述上转换纳米粒子上标记的核酸适配子为5’端带有羧基的与凝血酶特异性结合的核苷酸序列。

优选的，所述银纳米三角片上标记的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述所述上转换纳米粒子上标记的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述标记有核酸适配子的银纳米三角片的制备方法为将银纳米三角片与核酸适配子溶液混合过夜后离心，将离心后的沉淀分散于This缓冲溶液中。

优选的，所述标记有核酸适配子的上转换纳米粒子的制备方法为上转换纳米粒子去配体后与核酸适配子溶液混合后离心，将离心后的沉淀分散于Tris缓冲溶液。

本发明还提供了一种凝血酶的检测方法，包括如下步骤：

1)将标记有核酸适配子的银纳米三角片溶液与标记有核酸适配子的上转换纳米粒子溶液混合均匀，得检测体系；

2)在所述检测体系中加入待检测样品，进行拉曼光谱检测。