[发明专利]一种尿酸氧化酶的毛细管等电聚焦检测方法

说明书

本发明涉及一种检测尿酸氧化酶的毛细管等电聚焦方法，具体包括将两性载体、毛细管等电聚焦凝胶、尿素、阳极稳定剂、阴极稳定剂、等电点标记物和尿酸氧化酶样品按照一定浓度比例进行混合，上样于涂层毛细管，在合适温度、电压和聚焦时间下，通过毛细管电泳仪检测，可使待分析的蛋白样品中的各组分实现有效分离。该方法重复性好，可用于尿酸氧化酶类药物在生产过程中的质量控制。

技术领域

本发明涉及一种毛细管等电聚焦检测方法，用于测定尿酸氧化酶电荷异质性，该检测方法可以对尿酸氧化酶类药物进行良好的质控分析。

背景技术

尿酸是鸟类、爬行类和包括人在内的灵长类动物体内嘌呤代谢的终产物，因为在这些动物体内缺乏以分子氧为受体催化尿酸进一步分解为尿囊素、二氧化碳和双氧水的尿酸氧化酶。尿酸作为人体嘌呤代谢的终产物经肾脏排泄，当尿酸生成超过肾脏代谢能力或者当肾脏处于病理状态时就会都会造成血浆尿酸显著升高，形成高尿酸血症。由于尿素及其盐类在血液中的低溶解度和易沉积性就使得高尿酸血症会引发或加剧多种疾病，例如：持续高尿酸血症时尿酸结晶沉积在外周关节、滑膜引起的急性炎症和疼痛是痛风的主要病因；尿酸不仅可以刺激血管平滑肌细胞增殖，还将导致内皮细胞功能障碍；血浆高尿酸也是动脉粥样硬化等心血管疾病的重要危险因素；尿酸沉积在肾脏组织，是引发急性肾衰、肾小管损伤、IgA肾炎的主要原因，因此高尿酸血症会对自身健康带来诸多风险。

降尿酸的经典方案是用别嘌呤醇等黄嘌呤氧化酶抑制剂类药物降低尿酸生成，或用丙磺舒、苯溴马龙等药物促进尿酸排泄。黄嘌呤的水溶性低于尿酸，其积累有潜在的危险，黄嘌呤氧化酶抑制剂在初始尿酸浓度太高时疗效很差，还能引发超敏综合征，表现为发热、毒性上皮细胞坏死溶解、肝炎和嗜酸细胞增高，死亡率达20％，另外这类药和丙磺舒、苯溴马龙等促尿酸排泄类药都有明显肝肾毒性。因此，经典的降尿酸治疗策略不够安全而且疗效也不够理想。尿囊素的优良水溶性和肾脏对尿囊素的高效排泄能力使尿酸氧化酶成为治疗高尿酸血症及其继发症的理想药物：临床研究表明尿酸氧化酶可快速高效降低血清尿酸，且几乎没有毒副作用；在治疗肿瘤裂解综合征时，尿酸氧化酶比别嘌呤醇更安全有效；用于治疗痛风，能快速分解关节处沉积的尿酸从而消除引发的炎症和皮肤损伤。

尿酸氧化酶作为一种新型的降尿酸药物，其中一种重组黄曲霉尿酸氧化酶(商品名：拉布立酶)被欧美批准用于临床预防治疗肿瘤溶解综合征，因此尿酸氧化酶具有良好的成药性。当然作为蛋白类生物制品，良好的质量控制方法是其成药的重要因素之一。本发明将提供一种对尿酸氧化酶具有良好和稳定质量控制的分析方法。

本发明采用的尿酸氧化酶是从产朊假丝酵母中提取基因组DNA，通过PCR扩增，设计特定的引物，从产朊假丝酵母基因组中分离尿酸氧化酶基因，并将其插入到大肠杆菌表达质粒中，得到重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶转化子，再将重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶转化子转化入大肠杆菌中，得到可高效表达尿酸氧化酶的大肠杆菌工程菌株。再经过发酵培养，收获表达重组重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶的菌体，在经过菌体裂解、柱层析纯化得到纯化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶(详见发明专利ZL02819387.3)。不同种类的尿酸氧化酶对于尿酸的作用具有相同的作用方式和相似的理化性质，因此本发明的检测方法同样适用于其他尿酸氧化酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的基于毛细管电泳技术的尿酸氧化酶电荷异质性的分析方法，适用于尿酸氧化酶类药物的质控分析。

本发明涉及的毛细管等电聚焦检测方法包括以下步骤：

(1)将两性载体、毛细管等电聚焦凝胶、尿素、阳极稳定剂、阴极稳定剂、等电点标记物和待分析的尿酸氧化酶样品进行混合，形成混合液；

(2)将步骤(1)中的混合液上样于涂层毛细管，在合适温度、电压和聚焦时间下，通过毛细管电泳仪检测，得到等电聚焦谱图；

(3)根据步骤(2)的等电聚焦图谱中等电点标记物的迁移时间和pI值得到标准曲线，确定待分析的蛋白样品各组分的pI值；