[发明专利]一种创制耐热芥蓝种质的方法

权利要求书

1.一种创制耐热芥蓝种质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.以矮脚香菇芥蓝DNA为模板，构建含有如SEQ ID NO:1所示MBF1c基因的重组超表达载体；

S2.将S1得到的重组超表达载体转化农杆菌，得到重组农杆菌；

S3.用重组农杆菌转染芥蓝外植体，经培养获得转化植株，筛选得到耐热芥蓝。

2.根据权利要求1所述创制耐热芥蓝种质的方法，其特征在于，所述超表达载体的构建方法为：

S11.利用超表达引物扩增得到MBF1c基因的ORF全长；

S12.将S11克隆的片段连接到pBE-GFP载体，制得MBF1c基因的重组超表达载体。

3.根据权利要求2所述创制耐热芥蓝种质的方法，其特征在于，所述引物如SEQ ID NO:3～4所示，分别为：

MBF1-yxb–F:CGCGGGCCCGGGATCCATGCCGAGCAGAT；

MBF1-yxb–R:GGCGACCGGTGGATCCTTGACATGTTT。

4.根据权利要求2所述创制耐热芥蓝种质的方法，其特征在于，所述连接方法采用infusion技术。

5.根据权利要求1所述创制耐热芥蓝种质的方法，其特征在于，在农杆菌转染芥蓝外植体前，将所述芥蓝外植体放入分化培养基中，于25℃黑暗预培养2d。

6.根据权利要求1所述创制耐热芥蓝种质的方法，其特征在于，所述农杆菌转染芥蓝外植体后培养步骤如下：

S31.外植体侵染后接种至分化培养基中，在25±1℃条件下恒温黑暗培养2d；

S32.抑菌培养：接种于抑菌培养基中25℃培养3～5d；

S33.筛选培养：接种于卡那霉素筛选培养基上，每两周继代一次，继代2～3次，直到只有少许外植体能在筛选培养基上长出抗性芽，而大部分外植体在含卡那霉素的筛选培养基上褪绿，变黄白化为止；

S34.生根培养：当分化的不定芽伸长至1.5～2.5cm时，将其自基部切下，接种于生根培养基中诱导其生根，炼苗2～3d，移栽获得抗性芥蓝苗。

7.根据权利要求6所述创制耐热芥蓝种质的方法，其特征在于，所述重组农杆菌转染芥蓝外植体时的OD600为0.4～0.8，转染时间为9min。

8.根据权利要求6所述创制耐热芥蓝种质的方法，其特征在于，所述卡那霉素浓度为10mg/L。

9.根据权利要求6所述创制耐热芥蓝种质的方法，其特征在于，所述芥蓝外植体为无菌带柄子叶和下胚轴。

10.根据权利要求9所述创制耐热芥蓝种质的方法，其特征在于，所述无菌带柄子叶和下胚轴获得方法为：将芥蓝种子经75％酒精、2％次氯酸钠消毒后，用无菌水浸泡，倒去无菌水，吸去种子表面的水分，在25～28℃黑暗条件下培养2d，然后把种子取出放到25℃、光照2000lx 14h/d培养条件下培养，待芥蓝小苗子叶展平时切下子叶和下胚轴即可。