[发明专利]一种以谷氨酰胺转移酶为交联剂的体内止血敷料的制备方法

说明书

本发明公开了一种体内止血敷料的制备方法，该方法向类人胶原蛋白溶液中加入谷氨酰胺转氨酶进行交联后，通过设定的降温速度进行精确降温预冻，并真空冷冻干燥，然后Co60照射灭菌，最终获得一种体内止血敷料。本发明制备方法本发明所制备的体内止血敷料安全性高，生物相容性好，止血效果显著，可用作各类创面止血和术后止血，在医用生物材料与组织工程等相关领域有着良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种体内止血敷料的制备方法，特别涉及一种以谷氨酰胺转移酶为交联剂的体内止血敷料的制备方法，属于生物医用材料领域。

背景技术

胶原蛋白是一种高分子蛋白，一般呈白色、不透明的纤维状。它是生物体组成结构的主要成分之一，广泛地分布于动物的皮肤、骨骼和肌肉组织内。胶原具有止血性能，一方面可加强血小板的黏附和聚集形成血栓，阻止血液流出。另一方面，通过激活和诱导各种凝血因子还可启动内源性的凝血途径。但是胶原蛋白多来源于动物皮、筋腱等，可加工性差，在提取过程中会使蛋白部分生物活性丧失，而且其对人体而言属于一种异源物，可引起过敏等不良反应，应用于人体非常容易产生排异反应。因此需要寻找一种制备简单、安全性高的胶原蛋白作为原料。

谷氨酰胺转移酶是人体组织中本来就含有的一种酶，可与胶原蛋白发生交联反应，谷氨酰胺转移酶以肽键中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基作为酰基的供体，以多肽链中赖氨酰残基于氨基作为酰基的受体，形成蛋白质分子内和分子间的ε-γ（-谷氨酰）赖氨酸异肽键。热交联是在真空条件下加热，使胶原分子严重脱水，自由羧基和羟基发生酯化反应以及羧基与氨基之间发生酰胺反应，从而改善止血敷料的机械性能，而且还可以保持止血敷料的内部孔状结构不变，使孔隙均匀完整。

发明内容

本发明的目的是提供一种使用安全、可吸收、止血效果好的体内止血敷料的制备方法。

本发明的实现过程如下：

一种体内止血敷料的制备方法：以类人胶原蛋白为原料，加入注射用水搅拌溶解后，向类人胶原蛋白溶液中加入谷氨酰胺转氨酶进行交联后，通过控制降温速率为4-8 ℃/min进行降温预冻，真空冷冻干燥，Co60照射灭菌后得到体内止血敷料。

上述的类人胶原蛋白为使用基因重组大肠杆菌高密度发酵生产的一种人源型胶原蛋白。

上述的类人胶原蛋白加入注射用水后的质量浓度为1%-5%；谷氨酰胺转氨酶与类人胶原蛋白的比例为4-8U/g。

具体来说，上述的体内止血敷料的制备方法，包括如下步骤：

（1）将类人胶原蛋白溶解于注射用水中，使溶液中类人胶原蛋白的质量浓度为1%-5%；

（2）将溶液移入一次性无菌培养皿或模具中，每皿或每模具7-15 mL；

（3）加入谷氨酰胺转氨酶，谷氨酰胺转氨酶与类人胶原蛋白的比例为4-8U/g，反应温度为-4-0℃，交联时间为24-48小时；

（4）预冻过程中，降温速率控制为4-8 ℃/min；

（5）样品冻干处理24-72 h，冻干好的样品Co60照射灭菌10-30 h。

本发明具有以下优点：

（1）本发明所涉及的胶原蛋白为基因工程菌高密度发酵的人源性胶原蛋白，它从根本上解决了动物提取胶原蛋白的水不溶性和病毒隐患等问题，具有生物相容性好、促细胞生长、无病毒隐患和免疫排异反应低等优点，提高了体内止血敷料的安全性；

（2）本发明采用酶法交联，具体使用谷氨酰胺转氨酶交联胶原蛋白制备体内止血敷料，可以改善止血敷料的机械强度，提高止血效果，而且谷氨酰胺转移酶是人体组织中本身就含有的一种酶，其安全无毒，制备的止血敷料应用于临床时保证了其良好的生物安全性；