[发明专利]免疫亲和净化-液相色谱串联质谱测定贝类中腹泻性贝类毒素的方法

说明书

本发明公开了一种免疫亲和净化‑液相色谱串联质谱测定贝类中腹泻性贝类毒素的方法，样品采用80％甲醇水溶液提取，经磷酸盐缓冲液混合稀释后，免疫亲和选择专一净化，液相色谱串联质谱分析。根据腹泻性免疫亲和柱的使用特性，对上样液、淋洗液、洗脱液等参数进行了优化；电喷雾负离子电离，多反应监测模式，外标法定量。本发明基质干扰小、净化效果强、灵敏度高，适合贝类中腹泻性贝类毒素的分析测定。

技术领域

本发明涉及一种贝类中腹泻性贝类毒素的检测方法，特别涉及一种免疫亲和净化-液相色谱串联质谱测定贝类中腹泻性贝类毒素的方法。

背景技术

大田软海绵酸(Okadaic Acid，OA)及其衍生物鳍藻毒素(Dinophysistoxins，DTXs)是一类亲脂性聚醚类化合物(图1)，主要由有毒赤潮藻类鳍藻属和原甲藻属的部分藻类产生。当有毒微藻被双壳贝类滤食后，OA和DTXs毒素会在贝体内累积，导致贝类食用者中毒，出现腹泻、恶心、呕吐及下腹疼痛等症状，是腹泻性贝毒(Diarrhetic shellfishpoisons，DSP)中分布最广、危害最大的一类组分。除能引起腹泻外，OA和DTXs毒素还能损伤肠黏膜，是肿瘤促进因子，具有遗传毒性。欧盟对贝类组织中腹泻性贝毒的安全限量为160μg/kg，我国出入境检验检疫行业标准则规定任何腹泻性贝毒含量不得大于160μg/kg样品。我国东海海域是赤潮多发生区域，通过对长江口及邻近海域有毒藻类和赤潮毒素调查发现，该区域常年存在能产生腹泻性贝毒的具尾鳍藻和倒卵形鳍藻。考虑到该类毒素对人体健康的潜在危害，有必要加强贝类中腹泻性贝毒。

目前，用于腹泻性贝类毒素检测的方法主要有小鼠生物法、酶联免疫法、高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用等方法。小鼠生物法是调查检测腹泻性贝毒发展最早、应用最广泛的分析方法，但仅能指出毒性的大小，无法确定毒素的组成和含量，可比性较差。酶联免疫法反应迅速、成本低，但其准确度较差，易受交叉反应的影响而出现假阴性或假阳性。液相色谱法技术是有效的非生物检测法，但缺乏准确的定性能力，且需要复杂的前处理和繁琐的衍生步骤。液质联用技术结合了液相色谱优越的分离能力与质谱高灵敏度的定性定量功能，但现有文献多采用固相萃取技术净化样品，但回收率低、基质干扰仍较严重，导致方法应用率不高，无法有效监测腹泻性贝类毒素。免疫亲和柱(IAC)是一种基于抗原抗体反应的新型层析柱，利用特异性生物大分子抗体对另一类生物大分子特异识别和可逆结合特性制作而成，具有高度的选择专一性和良好的吸附净化性能。作为新型高效的前处理净化技术，免疫亲和净化技术正在不断的改进发展，但目前尚未有免疫亲和-液质联用检测技术应用于贝类中腹泻性贝类毒素同时检测的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫亲和净化-液相色谱串联质谱测定贝类中腹泻性贝类毒素的方法，基质干扰小、净化效果强、灵敏度高，适合贝类中腹泻性贝类毒素的分析测定。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种免疫亲和净化-液相色谱串联质谱测定贝类中腹泻性贝类毒素的方法，包括如下步骤：

(1)样品前处理：准确称取已充分均质样品2.00g于50mL具塞离心管中，加入10mL80％甲醇水溶液，涡旋振荡2min，超声提取10min，7000r/min离心5min，将上清液移至另一50mL离心管中；再往剩余残渣中加入10mL80％甲醇水溶液，重复提取一次，合并提取液；移取5mL合并的提取液至另一50mL离心管中，加入20mL PBS缓冲液进行稀释，待净化；

(2)免疫亲和柱净化：取出免疫亲和柱，待其恢复至室温后去掉亲和柱堵头，放出柱内保存液后，上样品液，上样结束后，用6mL 20％甲醇水溶液淋洗亲和柱，挤干柱内残留液，并弃去以上全部流出液，最后用3mL含有2％氨水的甲醇溶液洗脱，收集的洗脱液于50℃氮气吹干，用1mL初始流动相定容溶解，经0.22μm滤膜过滤后得净化液供液相色谱-质谱分析；