[发明专利]免疫亲和净化-液相色谱串联质谱测定贝类中腹泻性贝类毒素的方法

权利要求书

1.一种免疫亲和净化-液相色谱串联质谱测定贝类中腹泻性贝类毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)样品前处理：准确称取已充分均质样品2.00g于50mL具塞离心管中，加入10mL 80％甲醇水溶液，涡旋振荡2min，超声提取10min，7000r/min离心5min，将上清液移至另一50mL离心管中；再往剩余残渣中加入10mL 80％甲醇水溶液，重复提取一次，合并提取液；移取5mL合并的提取液至另一50mL离心管中，加入20mL PBS缓冲液进行稀释，待净化；

(2)免疫亲和柱净化：取出免疫亲和柱，待其恢复至室温后去掉亲和柱堵头，放出柱内保存液后，上样品液，上样结束后，用6mL 20％甲醇水溶液淋洗亲和柱，挤干柱内残留液，并弃去以上全部流出液，最后用3mL含有2％氨水的甲醇溶液洗脱，收集的洗脱液于50℃氮气吹干，用1mL初始流动相定容溶解，经0.22μm滤膜过滤后得净化液供液相色谱-质谱分析；

(3)液相色谱-质谱分析：净化液经液相色谱-串联质谱仪测定获得腹泻性贝类毒素的峰面积，将峰面积代入标准曲线分析计算，从而获得样品中腹泻性贝类毒素的含量；色谱柱：ACQUITYTMUPLC BEH C18柱，规格：2.1mm×100mm，1.7μm；进样体积10μL；样品室温度4℃；柱温30℃；流速0.3mL/min；流动相A为2mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈，梯度洗脱：0～3.0min，70％～25％A；3.0～3.5min，25％～70％A；3.5～5.0min，70％A。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中PBS缓冲液的配制方法为：分别称取二水合磷酸二氢钠2.18g，十二水合磷酸氢二钠12.90g，氯化钠8.50g，用水溶解并定容至1000mL。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中质谱条件为：电喷雾离子源，负离子扫描；检测方式：多反应监测模式；毛细管电压：3.2kV；离子源温度：115℃；脱溶剂气温度：370℃；锥孔气流量：60L/h；脱溶剂气流量：700L/h；锥孔电压50V，分析物母离子803.3-817.3m/z，子离子255.0、113.0m/z。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中标准曲线的制作方法为：配制浓度为1.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L和100.0μg/L的标准工作溶液，以峰面积对应的浓度绘制标准曲线。