[发明专利]一种蛋白质的分离方法

说明书

本发明提供一种蛋白质的分离方法，所述分离方法的分离过程采用反相/离子交换混合模式色谱填料，所述填料采用极性共聚的键合方法，硅胶表面同时键合非极性基团和极性基团，分离模式为反相/静电排斥作用，分离方法使用反相分离体系；所述反相/静电排斥作用是指，1)固定相表面的非极性基团提供反相疏水作用力；2)调节洗脱液的pH值为酸性到中性，使得固定相表面极性基团带正电，并且将洗脱液pH值设置为小于所要分离蛋白质的等电点使蛋白质带正电，带正电的蛋白质与固定相填料带正电的极性基团产生静电排斥作用,且因排斥力不同而使多种蛋白质分离。该方法具有稳定、高效、具有独特选择性的特点。

技术领域

本发明属于蛋白质的分离分析技术领域。

背景技术

蛋白质是各种生物有机体的重要组成部分，研究蛋白质对生物、医药和食品等领域有着重要的意义。有效的分离分析是进一步深入研究蛋白质的前提。目前，反相色谱是分离分析蛋白质的有效手段之一。硅胶基质烷基键合固定相是反相色谱分离蛋白质的最常用分离材料，但是，此类固定相只能提供单一的疏水作用力，对于复杂的蛋白质样品不能提供足够的分离选择性。因此，发展具有特异选择性的新型反相固定相对分离蛋白质具有重要意义。

当前，在常规反相固定相上引入多种作用力，补充反相色谱的极性选择性是色谱分离技术发展的重要方向[Buszewski,B.et al,Anal.Chem.,1997,69,3277-3284]。Gritti等[Gritti,F.et al,J.Chromatogr.A,2014,1374,112-121]研究了一种反相/电荷排斥固定相上的蛋白质分离峰型问题。Wang等[Wang,Y.X.et al,Chin.Chem.Lett.,2015,26,988-992]报道了一种离子液体修饰的反相/离子交换固定相用于选择性分离酸性蛋白质。因为蛋白质分子同时具有疏水性和电荷性，所以在反相固定相中引入电荷作用是有望改善分离选择性的。但是当前基于这类固定相的研发仍然较少。

发明内容

本发明涉及一种蛋白质的分离方法；本方法采用反相模式的分离方法，使用反相/离子交换混合模式硅胶填料，通过对洗脱液添加剂种类和浓度的优化、pH条件的优化以及流动相梯度条件的优化，利用反相/静电排斥作用达到分离蛋白质的目的，并具有独特的选择性。

本发明采用的技术方案为：

一种蛋白质的分离方法：分离过程采用反相/离子交换混合模式色谱填料，所述填料采用极性共聚的键合方法，硅胶表面同时键合非极性基团和极性基团，分离模式为反相/静电排斥作用，分离方法使用反相分离体系；

所述反相/静电排斥作用是指，1)固定相表面的非极性基团提供反相疏水作用力；2)调节洗脱液的pH值为酸性到中性，使得固定相表面极性基团带正电，并且将洗脱液pH值设置为小于所要分离蛋白质的等电点使蛋白质带正电，带正电的蛋白质与固定相填料带正电的极性基团产生静电排斥作用,且因排斥力不同而使多种蛋白质分离。

所分离的蛋白质的分子量为5-200kDa，等电点为3-12。

色谱填料硅胶表面键合的非极性基团为碳原子数为1～30的正链烷基和苯基的一种或多种，极性基团为带有胺基、季铵基的碳原子数为1-12的正链烷基中的一种或多种；填料粒径为2-10μm，填料孔径为

所述洗脱液为水相溶液与有机溶剂的混合。

水相溶液为纯水中加入甲酸、三氟乙酸、甲酸铵、乙酸铵、高氯酸盐或PBS缓冲盐的一种或多种，浓度为5-200mM，水相溶液pH值为2.5-7.0，所述高氯酸盐为高氯酸钠、高氯酸钾或高氯酸铵，高氯酸盐溶液中加入10-30mM的PBS缓冲盐用于调节pH值；有机溶剂为乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇的一种或几种，或与乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇中加入0.5-200mM的甲酸或三氟乙酸，有机溶剂的pH值为2.5-7.0。

优选的洗脱液pH值与所要洗脱的蛋白质中等电点最小值的差值大于0.5。