[发明专利]一种蛋白质的分离方法

权利要求书

1.一种蛋白质的分离方法，其特征在于：

分离过程采用反相/离子交换混合模式色谱填料，所述填料采用极性共聚的键合方法，硅胶表面同时键合非极性基团和极性基团，分离模式为反相/静电排斥作用，分离方法使用反相分离体系；

所述反相/静电排斥作用是指，1)固定相表面的非极性基团提供反相疏水作用力；2)调节洗脱液的pH值为酸性到中性，使得固定相表面极性基团带正电，并且将洗脱液pH值设置为小于所要分离蛋白质的等电点使蛋白质带正电，带正电的蛋白质与固定相填料带正电的极性基团产生静电排斥作用,且因排斥力不同而使多种蛋白质分离。

2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所分离的蛋白质的分子量为5-200kDa，等电点为3-12。

3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：色谱填料硅胶表面键合的非极性基团为碳原子数为1～30的正链烷基和苯基的一种或多种，极性基团为带有胺基、季铵基的碳原子数为1-12的正链烷基中的一种或多种；填料粒径为2-10μm，填料孔径为

4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：所述洗脱液为水相溶液与有机溶剂的混合。

5.根据权利要求4所述的分离方法，其特征在于：水相溶液为纯水中加入甲酸、三氟乙酸、甲酸铵、乙酸铵、高氯酸盐或PBS缓冲盐的一种或多种，浓度为5-200mM，水相溶液pH值为2.5-7.0，所述高氯酸盐为高氯酸钠、高氯酸钾或高氯酸铵，高氯酸盐溶液中加入10-30mM的PBS缓冲盐用于调节pH值；有机溶剂为乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇的一种或几种，或与乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇中加入0.5-200mM的甲酸或三氟乙酸，有机溶剂的pH值为2.5-7.0。

6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：优选的洗脱液pH值与所要洗脱的蛋白质中等电点最小值的差值大于0.5。

7.根据权利要求4所述的分离方法，其特征在于：在洗脱过程中，水相溶液与有机溶剂之比为99.8/0.2-10/90。

8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：称取适量蛋白质样品，用混合比例为99.8/0.2-50/50的水相溶液和有机溶剂的初始洗脱液配制成浓度为0.1-100mg/mL的蛋白质溶液待用，进样体积为1-50μL。

9.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：分离过程的参数为：

a.洗脱液pH值为2.5-7.0；

b.流速为线速度0.3-3.0mm/s；

c.柱温为30-70℃；

d.检测波长为200-220nm或260-290nm。

10.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：将疏水性和等电点存在差异的蛋白质样品：胰岛素、细胞色素C、溶菌酶、转铁蛋白和牛血清白蛋白，用混合比例为90/10的水相/有机溶剂溶解，配制成浓度1-10mg/mL的蛋白质溶液待用，进样体积1-50μL，采用液相色谱的方法进行分离；色谱填料硅胶表面键合的非极性集团为碳原子数4-8的正链烷基，极性基团为带有乙二胺基的碳原子数为2-4的正链烷基，填料粒径为2-5μm，填料孔径为

色谱分离条件为：柱温30℃，流速0.5-1.5mL/min；流动相水相溶液为0.1％体积浓度的三氟乙酸水溶液、有机相为0.1％体积浓度的三氟乙酸乙腈溶液，流动相梯度条件为有机相体积浓度从10％～60％，0-20min；紫外检测器，检测波长214nm；

或，将疏水性和等电点存在差异的蛋白质样品：肌红蛋白、碳酸酐酶，用混合比例为90/10的水相/有机溶剂溶解，配制成浓度1-10mg/mL的蛋白质溶液待用，进样体积1-50μL，采用液相色谱的方法进行分离；色谱填料硅胶表面键合的非极性集团为碳原子数4-8的正链烷基，极性基团为带有乙二胺基的碳原子数为2-4的正链烷基，填料粒径为2-5μm，填料孔径为色谱分离条件为：柱温30℃，流速0.5-1.5mL/min；流动相A相为甲酸铵水溶液，pH值为3.0-4.0，等度10-30mM；B相为乙腈，B相梯度为体积浓度10％-60％，0-20min；紫外检测器，检测波长280nm。