[发明专利]一种新的大鼠类风湿性关节炎的造模方法

说明书

技术领域

本发明提供一种新的大鼠类风湿性关节炎的造模方法，属于生物技术领域。

背景技术

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一类慢性炎性自身免疫性疾病，在全世界的发病率约为1%。RA动物模型可以模拟RA的发病，提供了RA的病理学、遗传学及分子生物学等资料，为研究RA的发病机制及治疗策略发挥了重要作用。因此，动物模型被广泛应用于RA的研究和新药研发当中。目前，用于研究RA的动物模型有多种，包括胶原诱导关节炎（collagen type II induced arthritis，CIA）、佐剂诱导关节炎(adjuvant arthritis，AA)、链球菌细胞壁诱导关节炎、降植焼诱导关节炎和蛋白聚糖诱导关节炎等。这些动物模型都存在不同程度的缺陷，存在个体造模稳定性低、批次间一致性差、造模成功率低等方面的问题，对研究结果造成很大的影响。

伯氏疏螺旋体是莱姆病的病原体，感染伯氏疏螺旋体后引起的慢性炎性莱姆关节炎可以导致关节软骨和骨质的破坏，进而造成永久的关节功能障碍。伯氏疏螺旋体蛋白的整体或部分可激活Toll样受体-2(Toll like receptor2，TLR2)和Toll样受体-4(Toll like receptor4，TLR-4)，活化关节组织内巨隨细胞进而释放炎性细胞因子，开始炎症反应。此后，螺旋体抗原被巨噬细胞加工处理后，提呈给CD4⁺T细胞并引起后者的活化。活化的CD4⁺T细胞可发挥细胞免疫反应并释放多种细胞因子，进而加重关节炎症并最终导致慢性关节炎。

寡核苷酸CGCpGGC是一种新型DNA佐剂，是Toll样受体9（Toll like receptor9，TLR9）的一个较强的激动剂，可以刺激免疫T细胞分泌TNF-α、IL-1、IL-6等多种细胞因子和炎性介质以产生炎症反应。所以，寡核苷酸CGCpGGC可以协同伯氏疏螺旋体蛋白，在诱导大鼠类风湿性关节炎中发挥重要的作用，成为制备大鼠类风湿性关节炎动物模型的一种有效成分。

不完全弗氏佐剂是用于制备免疫原的油包水乳液，可辅助抗原刺激机体出现高效长期的抗体应答，但单独使用其免疫大鼠并不能诱导出理想的关节炎模型。

基于此，本发明应用重组伯氏疏螺旋体P100蛋白、加上寡核苷酸CGCpGGC，结合不完全弗氏佐剂免疫Lewis大鼠，建立一种新的、稳定、高效造模的RA动物模型。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的大鼠类风湿性关节炎的造模方法，达到稳定高效的制备大鼠类风湿性关节炎动物模型的目的。

本发明提供的一种在Lewis大鼠中制备RA动物模型的方法，其技术解决方案如下：

1）使用超声波细胞粉碎仪将终浓度为5-10mg/mL的重组伯氏疏螺旋体P100蛋白、终浓度为1-3mg/mL的CGCpGGC寡核苷酸与不完全弗氏佐剂混匀，制成全菌蛋白乳化液，37℃内孵育20分钟（min）后待用；

试验组为18只Lewis大鼠，将制备的0.1-0.25mL全菌蛋白乳化液在大鼠右足足邸皮内注射，2周（w）后以0.1-0.25mL的全菌蛋白乳化液腹腔注射，加强免疫1次。对照组为18只Lewis大鼠，以相同的程序注射0.25mL，0.85% NaCl；

在造模后第16天（d），试验组大鼠RA造模成功率为88.89%以上，病变关节病理显示关节滑膜増生，炎细胞浸润，软骨组织及骨组织侵蚀，呈典型的关节炎病变。对照组大鼠没有出现任何症状和病理变化；

2）外观评分：

于造模后第6d、8d、10d、12d、14d、16d，采用关节炎指数(arthritis index，AI)评分法对关节肿胀程度及活动度进行评分，具体如下：

（1）0分,无任何改变；

（2）1分,仅足趾关节发病,包括皮肤变红,轻度肿胀；

（3）2分,足趾关节和足巧部均发病,包括皮肤变红,中度肿胀；

（4）3分,踝关节以下发病,包括皮肤变红,重度肿胀；

（5）4分,包括踝关节在内全部红肿,伴关节强直及活动受限；

造模后第16d，试验组大鼠的关节出现明显红肿，足部及踝关节肿胀最为明显，足趾成鼓捶状，且病变呈对称性；不能负重，行走困难。外观评分为3-4分。对照组大鼠无任何改变；

3）测量足跖部肿胀率：