[发明专利]一种新的大鼠类风湿性关节炎的造模方法

权利要求书

1.一种新的大鼠类风湿性关节炎模型的制备方法，包括以下步骤：

1）使用超声波细胞粉碎仪将终浓度为5-10mg/mL的重组伯氏疏螺旋体P100蛋白、终浓度为1-3mg/mL的CGCpGGC寡核苷酸与不完全弗氏佐剂混匀，制成全菌蛋白乳化液，37℃内孵育20分钟后待用；

试验组为18只Lewis大鼠，将制备的0.1-0.25mL全菌蛋白乳化液在大鼠右足足邸皮内注射，2周后以0.1-0.25mL的全菌蛋白乳化液腹腔注射，加强免疫1次；

对照组为18只Lewis大鼠，以相同的程序注射0.25mL，0.85% NaCl；

在造模后第16天，试验组大鼠RA造模成功率为88.89%以上，病变关节病理显示关节滑膜増生，炎细胞浸润，软骨组织及骨组织侵蚀，呈典型的关节炎病变；对照组大鼠没有出现任何症状和病理变化；

2）外观评分：

于造模后第6d、8d、10d、12d、14d、16d，采用关节炎指数评分法对关节肿胀程度及活动度进行评分，具体如下:

（1）0分,无任何改变；

（2）1分,仅足趾关节发病,包括皮肤变红,轻度肿胀；

（3）2分,足趾关节和足巧部均发病,包括皮肤变红,中度肿胀；

（4）3分,踝关节以下发病,包括皮肤变红,重度肿胀；

（5）4分,包括踝关节在内全部红肿,伴关节强直及活动受限；

造模后第16d，试验组大鼠的关节出现明显红肿，足部及踝关节肿胀最为明显，足趾成鼓捶状，且病变呈对称性；不能负重，行走困难；外观评分为3-4分；对照组大鼠无任何改变；

3）测量足跖部肿胀率：

在每只大鼠踝关节上缘划线做标记，于造模后第0d，2d，4d，6d，8d，10d，12d，14，16d用足趾容积测量仪测量对侧脚踝关节及其以下体积，详细记录并计算足跖部肿胀率；计算方法：

足跖部肿胀率(%)=(造模后第nd大鼠踝关节及其以下体积-造模后第0d踝关节及其以下体积)/造模后第0d踝关节及其以下体积×100%

其中，n表示测量时间点；

造模后第16d，试验组大鼠的足跖部肿胀率在63-78%，存在明显的改变；对照组大鼠无任何改变；

4）HE染色及病理学评价：

（1）标本收集：将大鼠断颈处死，切下注射对侧足踝关节，剔除皮肤和肌肉组织，10%中性福尔马林固定2-3d；

（2）标本脱钙、石蜡包埋及切片：将标本放入22倍体积的脱钙液中,置于恒温水浴箱保持37℃，每日振荡脱钙液1-2次，每10天更换一次脱钙液，脱钙5-7周；标本切割后脱水，石蜡包埋，常规切片；

（3）苏木素-伊红染色：

①二甲苯脱蜡5min,吸水纸吸干液体；

二甲苯第二次脱蜡lOmin至切片透明,吸水纸吸干液体；

②无水乙醇浸润5min；无水乙醇第二次浸润5min；95%乙醇浸润3min；流水2min,用吸水纸吸干水分；

③苏木素染色,4到8min，流水冲洗5min；

④1%盐酸水溶液分化5-10s，切片由蓝变红，流水洗返蓝15-30min；

⑤0.5%伊红染色,30s-1min；

⑥95%乙醇脱水5min，95%乙醇第二次脱水5min；

⑦二甲苯透明2-3min，二甲苯透明5min；

⑧中性树胶封片，镜下观察结果,拍摄病理图片；

（4）病理学评价：

HE染色后观察关节周围炎症、滑膜增生、血管翳形成及软骨下骨质破坏程度，对病理改变进行描述；

病理损伤评分分为5级：0分，正常；1分，轻微局部炎性细胞浸润；2分，中度炎性细胞浸涧；3分，重度炎性细胞浸润，无软骨损伤、血管翳形成；4分，重度炎性细胞浸润并伴有血管翳形成和(或)软骨、骨质破坏；在造模后第16d，试验组大鼠病理评价分数为3-4分，病变关节病理显示关节滑膜増生，炎细胞浸润，软骨组织及骨组织侵蚀，呈典型的关节炎病变；对照组大鼠没有病理损伤和病理变化。