[发明专利]一种竹柳抗真菌活性组分的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种竹柳抗真菌活性组分的制备方法及应用，属于天然产物有效成分的提取、分离纯化领域。

背景技术

竹柳(Salix ssp.)又称美国竹柳，为杨柳科(Saliaceae)柳属(Salix)植物，是美国寒柳、朝鲜柳和筐柳杂交的优良品系(王子成，2008)，其在继承传统柳属植物众多的优良品性的同时表现出生长快、材质好、抗性强等优点(张健等，2009)，是常用的速生用材林树种和生物质能源树种(徐克顺，2011)。

近年来，竹柳种植面积在我国迅速扩大，据统计，其成片林已超过1300hm²(胡国涛等，2016)，竹柳的储备量丰富，但目前竹柳的产业化尚不成熟，鲜有深加工产品和高附加值产品。而同属柳树作为药用的历史悠久，明代《本草纲目》中就记载“柳为本经下品，其性苦寒、无毒，可治疗风水黄疽，疮痈肿痛，痰热淋疾，湿痹等疾症”，且其各部分都可入药，可谓“全身都是宝”。现代有关柳属植物的化学和药理活性的研究表明，其化学成分包括黄酮类、酚苷类、苯丙素类、醌类、甾体类、萜类、有机酸类等，具有抗炎、止痛、抗氧化、抗菌、抗诱变、降压、利尿等药理作用(刘墨祥等，1997；封士兰等，2001；赵红娟等，2010；毛竹君等，2013)。故作为同属的竹柳，虽然目前与其化学成分和生物活性方面相关的研究鲜有报道。但已有研究表明竹柳表现出与同属植物相似的生物活性，有巨大的潜力可开发成高附加值的药品。

CN105237594A公开了一种从竹柳皮中提取水杨苷的制备方法，该方法是：将竹柳树皮粉碎后，采用连续微波干燥法，制得竹柳树皮粉，用无离子水超声逆流提取后得提取液，提取液经纯化、浓缩、干燥后获得水杨苷。该发明中仅就竹柳中的水杨苷进行了提取，而未对竹柳中其他有效成分进行提取研究。且现有技术中也未有将柳或竹柳具有抗真菌活性的提取物的相关报道，及将该抗真菌活性组分用于真菌感染治疗的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有的竹柳化学成分、生物活性等相关研究的不足以及以竹柳为原料开发的医药产品的空白，提供一种从竹柳皮中制备抗真菌活性组分的方法，并研究了该活性组分在医药产品领域中的应用。

为了实现上述目标，本发明的第一个方面在于提供一种竹柳抗真菌活性组分的制备方法，将竹柳皮粉末，用5至20倍无水乙醇超声提取1～5次，每次30-120min，得提取液；提取液经水沉及石油醚浸提，减压硅胶柱梯度洗脱，收集体积比为1:1的石油醚-乙酸乙酯混合液洗脱段的洗脱液，即得竹柳抗真菌活性组分。

具体步骤如下：

A)提取：以竹柳皮为原料，以无水乙醇作为溶剂，超声波提取，提取方法为原料粒度10～40目，料液比1:5～1:20，超声频率9～18KHz，超声温度20～50℃，超声时间30～120min，超声次数1～5次；

B)水沉及石油醚浸提：步骤A)的提取液减压浓缩至无乙醇残留，加入与原料等量的蒸馏水，于4℃条件下保存12～24h，离心，取下层沉淀，沉淀用10～20倍量石油醚于20～40℃条件下浸提12～24h，抽滤，滤液浓缩至一定体积，得浸膏；

C)VLC(减压硅胶柱层析)分离：200～300目硅胶湿法装柱，径高比1:5，步骤B)所得浸膏石油醚溶解，湿法上样，以石油醚-乙酸乙酯体系为洗脱剂，梯度洗脱，收集体积比为1:1的石油醚-乙酸乙酯混合液洗脱段，HPLC检测；

D)干燥及保存：步骤C)洗脱液减压浓缩至一定体积，真空干燥，经消毒、杀菌后，得到以粉末形式保存的具有抗真菌活性的竹柳石油醚提取物，即竹柳抗真菌活性组分粉末。

进一步，优选的所述步骤A)竹柳皮粉末原料粒度为24目，料液比为1：10，超声频率18KHz，超声温度30℃，超声时间60min，超声次数3次。

进一步，优选的所述步骤B)水沉时间为18h；所述的石油醚的沸点为60～90℃，石油醚浸提温度为30℃，浸提时间为18h。

进一步，所述步骤C)梯度洗脱溶剂为石油醚，石油醚：乙酸乙酯＝5:5以及乙酸乙酯，每个梯度梯度洗脱至流出液为无色时，更换下一个梯度，每个梯度洗脱3个柱体积的洗脱剂。

进一步，所述步骤C)的HPLC检测的色谱条件为0-20min，30-65％甲醇水，20-70min，65-90％甲醇水，70-80min，90-100％甲醇水，80-90min，100％甲醇，流速为1ml/min，检测波长为220nm，柱温：25℃，YMC-pack ODS A色谱柱(250×4.6mm，5μm)；