[发明专利]一种新型融合抗原和包含其的检测试剂盒及应用

说明书

本发明提供一种全新的融合抗原和包含该融合抗原的免疫检测试剂盒。所述融合抗原包含融合蛋白和目的抗原片段，此融合抗原在细胞上清中表达量较高，利用该重组抗原制备的免疫检测试剂盒的灵敏度、稳定性显著提高。

技术领域

本发明属于医学检测和诊断领域。具体地说，本发明涉及一种新型的融合抗原，包含该融合抗原的免疫检测试剂盒及其应用。

背景技术

戊型肝炎(简称戊肝)也称为肠道传播性非甲非乙型肝炎，由戊型肝炎病毒(Hepatitis E ViRus,HEV)感染所致。HEV在欧美少见，但在远东地区广泛流行，近20％的中国人带有戊型肝炎抗体，意味着曾受感染。猪和其他动物都可以携带戊型肝炎病毒，可能是此病毒的储源。孕妇感染HEV病情重，易发生肝功能衰竭，尤其妊娠晚期病死率高。HEV形态和基因组结构与杯状病毒较为相似，主要经消化道传播。急性病毒肝炎期内，血液里会出现IgM戊型肝炎抗体，三到数月后会被IgG抗体取代，并保持数年。

HEV是一种RNA病毒，基因组由非编码区，非结构区和结构区组成，有3个开放阅读框架(ORF1、ORF2和ORF3)编码病毒蛋白。ORF-1位于病毒基因组5’端，编码病毒非结构蛋白；ORF2位于病毒基因组3’端，编码病毒衣壳蛋白；ORF3位于ORF1与ORF2之间，与两者都有不同程度的重叠，编码病毒调控蛋白。目前戊型肝炎的血清学检测仍以检测抗HEV抗体为主，高质量的HEV免疫检测试剂盒的研制需要高质量的重组抗原。

各国在戊型肝炎防治领域的研究重点主要集中在疫苗和诊断方面。多年来，有效的HEV疫苗研制工作仍未成功，对HEV感染的及时和准确诊断成为了目前戊型肝炎预防控制工作中的重点。在戊型肝炎诊断方面，HEV抗体检测是目前HEV诊断的通用方法和重要手段。通过对各种血制品和受检人群的血液或其他体液进行HEV抗体筛查，能有效的检测出戊型肝炎病毒感染。

目前在HEV免疫抗体检测试剂盒中以间接法和捕获法的应用最为广泛。间接法主要测IgG，原理是：在酶免反应板上面包被HEV抗原，加入待检标本，孵育后加入已标记酶的二抗，标本中如存在HEV抗体，则HEV抗体将吸附到固相支持物上面，然后通过二抗上的酶结合物将信号放大，用酶标仪获得判定结果。捕获法主要检测IgM，原理是使用已包被抗人IgMμ链的反应板，加入样品稀释液和待测标本，孵育后加入经酶稀释液适当稀释的已标记的抗原酶结合物，孵育后加入显色液和终止液，酶标仪读取OD值。

HEV免疫检测试剂盒质量关键指标是灵敏度和稳定性，实质是由用于试剂盒的抗原的质量决定，而高质量的抗原需要在活性和稳定性方面均表现优秀。抗原活性和稳定性是由抗原的氨基酸组成决定的，一般的规律是，体外表达的重组抗原如果是在上清中表达量高、折叠充分，其构象将更接近天然抗原，活性和稳定性方面更好。

由于HEV抗原本身疏水性强，表达量低且活性差，获得的抗原量少，故大多数表达HEV抗原的方法就是在抗原上融合表达一段融合蛋白，形成融合蛋白-抗原的嵌合抗原，使用该方法表达出来的重组抗原在可溶性和表达量方面均有更好的表现，现有技术中普遍采用的融合蛋白有TRX(硫氧还蛋白)和GST(谷胱甘肽转移酶)等融合蛋白。这些融合蛋白运用在HEV抗原表达上有利于提高抗原的表达量，但融合蛋白用于检测试剂后均存在灵敏度不高、稳定性较差的情况。

因此，HEV免疫检测领域急需能够具备高抗原活性、高检测灵敏度和高稳定性的重组抗原，以便作为包被抗原或者标记抗原用作检测试剂来检测HEV抗体，提升试剂质量。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种可溶性好、折叠构象接近天然的HEV基因工程重组抗原，用它改善现有HEV抗体检测试剂盒的灵敏度、稳定性。

本发明的另外一个目的是为了提供一种可提高重组蛋白的表达量、可溶性、折叠正确的融合蛋白，含有编码该融合蛋白的核酸序列，以及含有上述核酸序列的质粒载体，克隆有上述质粒载体的宿主细胞克隆子。