[发明专利]TNF-α突变蛋白和甲醛灭活PD载体蛋白的化学偶联产物及其制备方法

说明书

本发明为“TNF‑α突变蛋白和甲醛灭活PD载体蛋白的化学偶联产物及其制备方法”，提供了靶向肿瘤坏死因子α（TNF‑α）疫苗制剂的蛋白抗原及其制备方法和用途。具体地，本发明“TNF‑α突变蛋白和甲醛灭活PD载体蛋白的化学偶联产物及其制备方法”的蛋白质抗原包括重组表达的hTNF‑α突变体蛋白和流感嗜血杆菌的D蛋白（PD），二者用戊二醛偶联。所述的蛋白抗原与氢氧化铝佐剂合用后，具有强的免疫原性，能激发小鼠产生显著的针对人TNF‑α的免疫反应。

技术领域

本发明属于生物和医药领域，具体地涉及一种具有强免疫原性的的肿瘤坏死因子α（TNF-α）疫苗的制法和用途。

背景技术

肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 作为一种重要的免疫调控分子，在细胞的生长、分化以及死亡等生理和病理过程中发挥重要的作用。TNF-α是一种主要由单核细胞或巨噬细胞产生的细胞因子，不仅能选择性地杀伤某些肿瘤细胞，而且有多种免疫调节功能。近年来研究发现，多种人类疾病和体内TNF-α的表达水平高有关，例如类风湿性关节炎等自身免疫性疾病和恶性肿瘤等。抑制TNF-α的功能已被证实可有效治疗上述疾病。事实上，在过去10年-15年中，美国FDA已批准5种TNF-α抑制剂，用于治疗包括类风湿性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎、克罗恩病等自身免疫性疾病。这些抑制剂全部为单克隆抗体，包括Remicade、Humira、Simponi、Cimzia和Enbrel。这些药物是目前世界上最畅销的生物制剂。2014年，Humira、Remicade和Enbrel的销售额分别达到125.4亿美元、92.4亿美元和85.38亿美元。

单克隆抗体药物具有一些缺点，包括用药剂量大（100 mg），使用频繁（2-4次/月），费用昂贵，以及会产生抗药性抗体，因此在中国只有不到10%的患者能够长期使用。预防型疫苗是人类医疗史上最伟大的发明，在上个世纪挽救了上百万人的生命。近年来针对自体蛋白的治疗型疫苗也迅速发展，到目前已有20多个针对高血脂、高血压、肥胖、自身免疫性疾病和肿瘤等慢性疾病的疫苗进入临床试验。与单克隆抗体相比，疫苗用药剂量少（100ug），使用不频繁（2-3次/年），费用相对较低以及不产生抗药性抗体。因此研发靶向TNF-α的疫苗被认为在保持抗体药物治疗疾病的效果的同时，可有效解决单克隆抗体药物的各种缺点。

目前多种以TNF-α为靶点的疫苗已经进展到不同的阶段治疗。由于免疫耐受机制的存在，自体蛋白单独注射免疫并不能诱导产生抗体。为自体蛋白提供外源Th表位已被证实可有效帮助打破免疫耐受，赋予自体蛋白免疫原性。在mTNF-α分子中通过插入非天然的硝基酪氨酸从而引入外源的Th表位。结果证实该抗原可成功打破小鼠的免疫耐受，诱导产生针对mTNF-α的中和抗体。但是用该方法构建的抗原，TNF-α保留生物活性，因此免疫时会引起副作用。2006年Le Buanec等将hTNF-α通过戊二醛化学偶联到载体蛋白钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet emocyanin, KLH)上，通过甲醛可有效灭活TNF-α的活性。但是遗憾的是，该抗原在II期临床试验中并没能诱导产生的针对hTNF-α的中和抗体。因此开发新的针对TNF-α的疫苗具有重要意义，而这些疫苗的制备需要解决两个问题：（1）去除TNF-α的生物活性，降低抗原的毒副作用；（2）保留抗原的免疫原性，在体内能有效诱导产生中和TNF-α的抗体。

hTNF-α蛋白上的个别氨基酸残基影响其生活活性。本研究室前期研究发现，在氨基酸序列87位和145位进行氨基酸替换（Y87H/A145R）后，突变蛋白的生物活性相对于野生型hTNF-α的0.000897%，即活性几乎丧失，但是在小鼠体内其免疫原性跟野生型hTNF-α的相当。因此该突变蛋白是一个非常好的抗原，可用于TNF-α疫苗设计。