[发明专利]一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7‑5‑3的基因编辑方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域的基因编辑技术，确切地说是一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因编辑方法。

背景技术

维吉尼亚链霉菌IBL14(Streptomyces virginiae IBL14)是我们从甾体药物生产厂家附近的污泥中分离筛选到的一株放线菌，它能够有效的转化和降解孕酮，黄酮，皮质醇和胆固醇等多种甾体类化合物_ENREF_1（Wang, F.-Q.; Zhang, C.-G.; Li, B.; Wei, D.-Z.; Tong, W.-Y., New microbiological transformations of steroids by Streptomyces virginiae IBL-14. Environmental science & technology 2009, 43 (15), 5967-5974）。CRISPR（clustered regμlarly interspaced short palindromic repeat sequences）称为成簇规则间隔的短回文重复序列，最先于20世纪八十年代发现于大肠杆菌中_ENREF_1（Ishino, Y.; Shinagawa, H.; Makino, K.; Amemura, M.; Nakata, A., Nucleotide Sequence of the iap Gene, Responsible for Alkaline Phosphatase Isozyme Conversion in Escherichia coli, and Identification of the Gene Product. JOURNAL OF BACTERIOLOGY 1987, 169 (12), 5429-5433）。2002年R．Jansen等详细比较分析了原核生物基因组中的这种成簇规则间隔的短回文重复序列，发现了该重复序列的旁侧经常伴随出现保守的基因序列_ENREF_1（Jansen, R.; Embden, J. D.; Gaastra, W.; Schouls, L. M., Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol 2002, 43 (6), 1565-75），他们将这种独特的重复序列命名为 CRISPR，保守基因序列编码的蛋白质称为Cas附属蛋白(CRISPR-associated proteins)。目前已发现CRISPR-Cas系统广泛分布于原核生物中_ENREF_1（http://crispr.u-psud.fr/），已商业应用于基因编辑的仅为CRISPR-Cas II型系统中的Cas9蛋白。

迄今为止，CRISPR-Cas I型系统虽有诸多发现，但未见可应用于基因编辑的报道。先前，我们应用维吉尼亚链霉菌IBL14中的type I-B-sv14型CRISPR-Cas 系统结合一个工程的基因编辑质粒可对维吉尼亚链霉菌IBL14自身染色体进行基因编辑_ENREF_1（童望宇; 雍德祥; 李雪; 邱彩花一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法. 2015110028173, 2015），但未能实现对其它生物基因组进行基因编辑。本发明将维吉尼亚链霉菌IBL14 type I-B-sv14型CRISPR-Cas 系统中的基因cas7-5-3与质粒（plasmid）连接得到一个Cas7-5-3蛋白表达质粒plasmid-cas7-5-3，结合设计的基因编辑质粒（plasmid-t/gDNA）或其它质粒首次实现了在原核生物大肠杆菌与枯草杆菌中的基因编辑。且该Cas7-5-3蛋白（含1323个氨基酸）具有与Cas9蛋白（含1368个氨基酸）相近的分子大小。