[发明专利]中华蜜蜂AccCDK5基因及AccCDK5r1基因及其应用

说明书

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及中华蜜蜂AccCDK5基因及AccCDK5r1基因在抗氧化过程中的作用及其应用，提供了两个中华蜜蜂基因AccCDK5与AccCDK5r1的克隆及重组载体构建方法，并提供AccCDK5蛋白与AccCDK5r1蛋白互作的证据及AccCDK5重组蛋白体外的抗氧化能力定性研究方法，为中华蜜蜂优质新品种的选育提供一定的理论基础，同时丰富了蜜蜂神经系统的研究，为研究蜜蜂神经系统发育及神经性病变提供理论基础。

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及中华蜜蜂AccCDK5基因及其AccCDK5r1基因的克隆、重组载体的构建，并首次在中华蜜蜂中验证了AccCDK5及其激活子AccCDK5r1的互作关系，提供了AccCDK5重组蛋白体外的抗氧化能力定性研究方法。

背景技术

细胞周期蛋白依赖性激酶-5(cyclin-dependent kinase-5，CDK5)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于细胞周期蛋白依赖性激酶家族CDKs。近年来的研究表明，在哺乳动物中，CDK5 并不参与细胞周期的调控，而是主要在神经系统中发挥作用，参与神经元迁移、肌动蛋白的运动、微管运输及其稳定性、细胞粘附、轴突导向、突触结构可塑性、肌细胞生成和膜运输等多种细胞活动。CDK5的功能失调和异常分布会导致神经系统障碍，并有可能导致神经退行性疾病。

非周期蛋白素蛋白p35、p39是CDK5的两个激活子，特异地分布在中枢神经系统中，因此CDK5的激酶活性的激活主要局限于神经系统中。p35具有膜锚定信号基序，从而使CDK5/p35锚定于膜上发挥作用。p35不稳定，半衰期只有20-30min，可通过泛素化途径被降解失活。此外，p35可在神经性毒性刺激的条件下裂解为p25，p25与p35都具有激活 CDK5的能力，不同的是p25缺少膜锚定信号基序，从而导致CDK5/p25复合体定位发生改变，同时由于p25的半衰期要比p35长很多，致使CDK5/p25无节制地磷酸化其下游底物，最终导致一系列病理变化。此外，有文献报道，H₂O₂诱导激活CDK5可以防止细胞在氧化胁迫中死亡。

目前对于CDK5及其激活子的研究大部分集中于哺乳动物的神经性病变、肿瘤发生等病理研究及其他基础研究中，昆虫中的相关研究少有报道，在中华蜜蜂中未见相关报道。

中华蜜蜂(Apis cerana cerana)属于东方蜜蜂的一个亚种，有7000万年进化史，是我国最具优势、分布最广的本土蜂种。长期的进化过程中，中华蜜蜂对我国的气候、蜜源分布等生态环境产生了极强的适应性，具有善于利用零星蜜源植物、采集力强、抗螨及抗病能力强等优点。

中华蜜蜂具有良好的经济效益和重要的生态作用，然而由于近年来西方蜜蜂的引入、病虫害以及毁林造田、滥施农药、环境污染等因素，使中华蜜蜂蜂群数量骤减，种群延续已经受到了极为严重的威胁。

发明内容

本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了中华蜜蜂AccCDK5基因基因在抗氧化过程中的作用及其应用，提供了两个中华蜜蜂基因AccCDK5与AccCDK5r1的克隆及重组载体构建方法，并提供AccCDK5蛋白与AccCDK5r1蛋白互作的证据及AccCDK5重组蛋白体外的抗氧化能力定性研究方法，为中华蜜蜂优质新品种的选育提供一定的理论基础，并为中华蜜蜂神经系统相关研究提供基础。

本发明中，我们用常规方法从中华蜜蜂(Apis cerana cerana)中克隆得到AccCDK5 基因及其AccCDK5r1基因，分析了两个基因的结构域并进行了进化树分析，标出了其保守结构域；构建了酵母双杂交实验相关载体，验证了其相互作用关系；构建了AccCDK5的原核表达载体，用于诱导蛋白并进行了纸片扩散实验，发现AccCDK5重组蛋白具有一定的抗氧化功能。本发明初步中华蜜蜂中AccCDK5与其激活子AccCDK5r1的互作关系，验证了AccCDK5重组蛋白的抗氧化功能。