[发明专利]一种降低深低温冻存组织器官冰晶损伤的方法

说明书

本发明提供了一种降低深低温冻存组织器官冰晶损伤的方法，本发明提供的这种低温冻存器官的处理方法，在器官待冷冻前使用干细胞条件培养基灌注，提高了组织细胞的生存状态，增加了抗凋亡能力，减少了细胞在离体后发生的氧化应激损伤；在复苏后立即使用含鲜活间充质干细胞的完全培养基进行后灌注处理，对冻存过程中受到冷冻保护剂毒性和渗透损伤的细胞进行主动修复，可有效减少细胞凋亡比率，减少组织结构的破坏。

技术领域

本发明属于临床医学的器官组织深低温冻存领域，公开了在器官组织深低温冻存前后，使用间充质干细胞及其分泌产物灌注，从而达到减少细胞凋亡、降低冰晶对细胞膜损害的一种预处理和后处理的方法。

背景技术

器官移植是治疗严重器官衰竭的最终手段，但是供体捐献和受体准备总是存在时间和空间的差异，因此，进一步开发更安全长效的器官冷冻保存——复苏方法成了亟待解决的问题。

生物组织的冷冻冻存过程包括冷冻保护剂的灌注、程控降温，深低温储存，复苏解冻及冷冻保护剂的置换清洗。每个步骤都影响着冷冻后器官中细胞的存活率及组织结构功能的保持。1972年，Mazur等首先从中国仓鼠组织培养细胞低温冻存的实验中，提出冷冻损伤的两因素假说。一是溶质损伤效应，是指冷却速度过慢，导致细胞外溶质浓度升高。二是机械损伤效应，是指冷却速度过快，细胞内形成冰晶直接损伤细胞的膜结构。

为了降低冻存对细胞的破坏，现在多使用玻璃化冻存，使液体粘稠度提高，在冷冻固化过程中减少内部晶体形成。溶液实现玻璃化主要靠提高冷却速率和增加溶液浓度，这就需要使用冷冻保护剂。但是，冷冻保护剂本身也会对细胞造成损伤，高浓度保护剂会对细胞和组织形成毒性作用，而在复温后洗脱的过程中还会造成细胞膜内外的渗透压差，形成渗透损伤。因此，当今深低温研究的重点就在于减少玻璃化过程中冷冻保护剂的损害。现有实验的方向主要有改善导入和洗脱方式，使用“连续导入法”；加快保护剂渗透的“负压浸渍技术”；使用不同种类冷冻保护剂使其相互稀释的复配技术。但是，冷冻保护剂除了自身特性外，在不同细胞组织中的保护和毒性作用也不尽相同。而器官并不是多种细胞的简单集合，作为结构复杂的复合组织，其降温过程中各部分温度分布不均匀导致的冷却速率的差异和各种细胞对冷冻保护剂的敏感性不同使其低温冻存的难度大为增加。因此，寻找新的组织细胞冷冻保护方法及修复损伤的方法极为重要。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种在冷冻冻存器官过程中，应用脐带间充质干细胞及其条件培养基进行组织内预灌注和后灌注的方法，可有效的提高组织的自我修复能力，有效提高复苏后组织内活细胞的比例，使组织器官在复温后更好的恢复功能。

本发明涉及的器官深低温冻存方法，包括以下步骤：

1) 将待冷冻的器官连接预冷至4℃的梯度浓度混合程控降温器官灌注仪，灌注25℃恒温的间充质干细胞条件培养基，灌注时间为30-60 min；

所述间充质干细胞条件培养基为传代5代内脂肪、脐带、脐血或骨髓中的一种的间充质干细胞，在传代后24h后长到70~80%汇合，更换无血清间充质干细胞培养基，48h后收集的培养上清，经1000~3000g离心10~30min，取上清后使用0.1µm~0.22µm微孔滤膜过滤后所得；

2）然后向器官灌注预冷至4℃的冷冻保护剂，灌注时长30min；

3）将处理完毕的器官放入冷冻袋，封口后置于程控降温仪中，按照设定降温程序进行程序化降温，待其温度降至-80℃后投入液氮中存放；

所述程控降温仪降温程序设定为①4℃平衡，②以1℃/min的速度降至0℃，并保持10min，③以2℃/min的速度降至-18℃，保持15min，④以2℃/min速度降至-45℃，保持15min，⑤再以5℃/min的速度降至-90℃，保持5min；

4）复苏器官时，将冻存器官自液氮取出后置于37℃水浴中，不断摇动；