[发明专利]一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的制备方法与应用

说明书

本发明提供一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的制备方法与应用，该方法利用软蚀刻技术制备了具有微米尺度的阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片。通过优化微柱结构的高度和间距来控制干细胞来源的拟胚体的形状、大小、均一性。该方法可以高通量形成拟胚体，并可以原位动态观察拟胚体增殖、发育的全过程。该芯片具有可以有效去除凋亡细胞和细胞碎片，保证拟胚体之间的营养供给和信号传递的特点，克服了传统拟胚体形成和悬浮培养分步实现的缺点，具有简化拟胚体操作步骤，高通量、原位形成与分化的优势，无需特殊的仪器和试剂，可与其他技术集成化。

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的制备方法与应用。

背景技术

诱导性多潜能干细胞和胚胎干细胞具有自我更新和多向分化的能力，在人体发育学研究，疾病模型构建，组织工程，细胞治疗，药物筛选等领域具有重要的应用价值。利用该细胞进行器官发育和细胞诱导分化过程中，拟胚体形成是关键的步骤。传统方法是利用悬滴法、以及商品化的小坑形成拟胚体。悬滴法具有操作繁琐，拟胚体形成效率低，营养供给缺乏等缺点。商品化的小坑结构在拟胚体形成后，由于小坑的结构使得死亡细胞和细胞碎片很难清除，这些细胞碎片会影响拟胚体的分化诱导效率。因此，应用这些方法形成拟胚体后，需要将拟胚体转移到低黏附的培养板中继续生长以及后续的诱导分化，使得实验步骤繁琐。此外，在转移过程中，拟胚体容易收到较大流体的剪切力刺激，干扰细胞的活性和分化的效果。

制备高通量阵列微柱结构的芯片的材料为聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)，PDMS是目前微加工和微流控领域用的最多的材料，具有透明、透气、惰性好、疏水性、易成型、细胞相容性佳等优势。目前文献报道的制备细胞球或者拟胚体的方法都是基于PDMS或者聚合物凝胶材料的小坑法，进一步研究需要转移细胞微球和拟胚体到新的低黏附培养系统，步骤繁琐；转移过程中对干细胞会造成一定程度的损伤，细胞碎屑不容易清除等缺点。目前形成拟胚体的方法是微流控技术的小坑芯片和悬滴法，主要缺陷是死亡细胞碎片不能及时清除，需要转移到新的低粘附培养皿中继续培养和分化，转移过程对拟胚体具有不同程度的损伤和丢失，而且无法实现原位拟胚体形成及培养，不能实时定位观察同一个拟胚体的发育分化过程。

目前利用微流控芯片制备的微柱结构中，主要以微小尺度为主，用于研究表面拓扑结构对单细胞行为学的影响，尚无利用较大微柱形成微培养空间进行拟胚体形成和原位发育研究的应用。

因此，本发明主要针对上述拟胚体形成局限性，制备一种新型的高通量拟胚体形成与原位生长培养的芯片，用于干细胞领域的应用研究。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的制备方法与应用。

一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的制备方法，具体步骤如下：

(1)芯片的制备：利用软蚀刻技术制备SU-8模板，含有高通量圆柱形的凹陷结构，底部为凹陷的曲面，对模板进行低黏附修饰，确保SU-8与PDMS聚合物容易剥离；

(2)制作高通量阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片：将PDMS聚合物与引发剂按照体积比10～14：1混合，浇注到SU-8模板上，真空除泡，80℃加热固化1～2h，常温剥离SU-8模板，得到高通量的固定间距的阵列微柱结构PDMS芯片；

(3)在PDMS芯片周边用PDMS模块形成围墙样结构的局限的开放培养池，得到高通量形成拟胚体的微阵列芯片。

芯片形状为圆形或者方形。

所述模板低黏附修饰具体为：采用低粘附处理试剂硅烷化处理10-15分钟，80℃烘烤1～2小时，自然降温。

所述低粘附处理试剂为三甲基氯硅烷或者全氟硅烷等；

所述模板凹陷小坑的深度在500-1000微米之间，间距在30-100微米之间。